Modelagem Neural Sinalização Imune de migrânea episódica e crônica Usando a depressão alastrante In Vitro

O objetivo deste vídeo é ilustrar como as culturas de fatias de hipocampo podem ser usadas para decifrar a sinalização imunológica neural que modula a suscetibilidade à propagação da depressão, a causa subjacente mais provável da aura da enxaqueca e talvez da enxaqueca. A depressão disseminada é facilmente evocada em culturas de fatias do hipocampo. Como as culturas são mantidas in vitro por semanas, o comportamento de tipos de células individuais pode ser medido, imitado e modulado por longos períodos.

Isso é especialmente importante para o estudo da sinalização imunológica neural. Como as fatias do cérebro do hipocampo maduro atingem um estado imunológico quiescente, as respostas imunes da depressão disseminada podem ser avaliadas sem os efeitos potencialmente confusos da anestesia usando técnicas modernas de biologia molecular. A detecção sensível de citocinas sinalizando de apenas 50 células a aproximadamente 90.000 células em uma fatia pode ser determinada de acordo.

As culturas de fatias de cérebro do hipocampo são ideais para uso no desenvolvimento de novas terapias imunes neurais para aliviar a enxaqueca. Meu nome é Yian Berg e aqui é Aya Puss e Heidi Mitchell do laboratório de Richard Craig e do Departamento de Neurologia do Centro Médico da Universidade de Chicago. Hoje vamos demonstrar o uso de hipocampo de rato, piolhos, culturas e o estudo da sinalização imunológica de baixo nível da depressão disseminada.

A depressão disseminada é um evento neural paroxístico que é desencadeado por uma explosão de aumento da atividade sináptica que é rapidamente seguida por uma perda transitória de toda a atividade. Evidências crescentes mostram que a sinalização imunológica de baixo nível pode influenciar e, em troca, ser influenciada pela atividade sináptica dentro do cérebro. Nossa hipótese é que as citocinas modulam a suscetibilidade à propagação da depressão e, como resultado, a aura da enxaqueca e talvez a enxaqueca também.

Os procedimentos que descrevemos aqui são projetados para minimizar a ativação de células imunes potencialmente confusas e aumentar nossa capacidade de detectar sinalização imunológica de baixo nível. Isso nos permite detectar a mais ampla gama de sinalização imunológica neural e suas interações com a propagação da depressão. Para iniciar este procedimento, faça eletrodos de aterramento cortando tubos de vidro em comprimentos de 4,5 milímetros.

Em seguida, polir brevemente as seções cortadas em ambas as extremidades. Em seguida, leve 100 mililitros de cloreto de potássio molar para ferver, adicione 3,5 gramas de ágar e 0,5 gramas de EDTA. Mexa a mistura continuamente para obter uma solução amarela clara.

Encaixe um pedaço de tubo flexível curto sobre cada tubo de vidro. Em seguida, puxe a solução agrícola de cloreto de potássio quente para o tubo de vidro e a uma curta distância para o tubo flexível. Solte a sucção e deixe o ágar cloreto de potássio escorrer lentamente da ponta aberta do tubo de vidro.

À medida que o ágar-ágar escorre, toque em um pedaço de gelo com a ponta do tubo de vidro aberto, o que fará com que o ágar-ágar gelifique na ponta do eletrodo e não gelifique depois de recuar de volta para o tubo de vidro. Assim que o ágar-ágar estiver gelatinoso, remova suavemente o tubo flexível sem alterar a posição do ágar. Nos tubos de vidro, coloque 0,5 mililitros de cloreto de potássio molar em cada poço de um rack de tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.

Em seguida, coloque a ponta de cada tubo de vidro de cloreto de potássio em poços individuais para manter as pontas úmidas. Em seguida, segure um fio de prata calibre 80 centímetros de comprimento 15 com um hemostático. Limpe cada um dos quatro lados raspando o fio através de uma lixa presa à bancada.

Depois disso, corte o fio em comprimentos de quatro centímetros. Coloque-os em um frasco de cintilação cheio de água sanitária por 20 a 30 minutos. Para colocar uma camada firme de prata a cloreto de prata sobre a superfície de prata limpa, dobre o fio ao meio e insira-o no tubo de vidro cheio de ágar cloreto de potássio, deixando cerca de quatro a seis milímetros expostos.

Em seguida, cubra a ponta do tubo de vidro contendo o fio de prata e uma pequena extensão do fio com gosma, uma cola resistente à água e flexível para evitar que o ágar cloreto de potássio seque, repita para todos os eletrodos e deixe a cola secar durante a noite. Após a coleta, armazene os eletrodos em frascos de cintilação com cinco mililitros de cloreto de potássio molar e 25 miligramas de EDTA. Cerca de cinco a seis eletrodos por frasco a quatro graus Celsius.

Faça eletrodos de gravação com tubos de vidro de silicato bo com filamentos. Em seguida, faça um eletrodo estimulante cortando cerca de 20 centímetros de comprimento de merídio de platina revestido de Teflon. Em seguida, dobre o comprimento ao meio, amarre as pontas soltas em um nó quadrado solto, deixando cerca de dois centímetros do nó até as pontas do fio.

Prenda o nó no mandril de uma furadeira elétrica colocada sobre uma mesa enquanto segura a outra extremidade do fio com um hemostático. Ligue e desligue brevemente a furadeira até que o fio esteja bem torcido. Para prender os fios torcidos de merídio de platina aos fios condutores, primeiro prenda o fio torcido de merídio de platina em uma bancada e solte uma poça de ácido clorídrico concentrado sobre uma extremidade livre do fio trançado.

Em seguida, coloque a extremidade descascada em um fio condutor adjacente à extremidade do fio torcido e aplique calor de um ferro de solda de ponta fina e solde até que os dois fios estejam firmemente presos. Deslize um pequeno pedaço de tubo termorretrátil sobre a conexão do fio exposto e encolha-o com fogo térmico. Polir a ponta de uma pipeta de 15 centímetros e guiar o fio do meridiano de platina torcido pela pipeta.

Use um epóxi repelente de água para selar ambas as extremidades do eletrodo. Finalmente, conecte plugues banana às extremidades do fio condutor para a conexão ao isolador de estímulo sob observação estereoscópica. Coloque a ponta do eletrodo em PBS e procure bolhas produzidas eletrolíticas provenientes apenas da extremidade cortada das pontas dos eletrodos, se houver bolhas nas laterais dos fios trançados.

Corte o eletrodo transversalmente usando uma lâmina de barbear de borda única para restabelecer o isolamento intacto dos eixos longos dos fios. Ao solucionar problemas para resolver efeitos de estímulo aberrantes, tente fazer uma ponta de eletrodo recém-cortada. Outra etapa importante é preparar as placas de gravação, que consistem em uma inserção de cultura de fatias e uma placa de cultura de 35 milímetros que fica em duas hastes de vidro de 1,0 x 12 milímetros espaçadas cerca de 1,0 centímetros de distância.

As hastes de vidro são fixadas à base do prato aquecendo os tubos de vidro e, em seguida, pressionando-os na base com uma pinça. Para condições de gravação estática, adicione 1,5 mililitros de mídia ao prato. Em seguida, mergulhe um pedaço de algodão estéril com 10 milímetros de largura e três a quatro centímetros de comprimento.

Em 1,0 mililitros de mídia, dobre o algodão ao meio ao longo do eixo longo e coloque-o ao longo da parede interna do inserto. Com pinça estéril, o algodão úmido ajuda a manter a umidade do prato. Três pedaços de tubo compressíveis de quatro milímetros de comprimento são igualmente espaçados ao redor do inserto.

Cubra bem o prato com filme de cloreto de polivinila para permitir a troca gasosa. Em seguida, corte ao redor da parede vertical média com uma lâmina de barbear de borda única para remover o excesso de cloreto de polivinila. O filme evoca um potencial de campo de três com pulsos de 100 microssegundos a 0,2 hertz, começando com uma corrente de cerca de um a cinco microamperes que é suficiente para desencadear uma resposta.

Mova o eletrodo de registro em incrementos ao longo do eixo longo do neurônio parametálico até que o potencial de campo seja máximo. Em seguida, aumente a corrente com um eletrodo de gravação nesta posição e observe a resposta máxima da corrente de cerca de 10 a 20 micro amperes. Finalmente, use metade da intensidade máxima do estímulo para experimentos para determinar o limiar para depressão disseminada evocada transsinapticamente.

Mude o paradigma de estimulação para evocar manualmente rajadas únicas de 100 microssegundos por pulso a 10 hertz. Aumente progressivamente a intensidade da corrente por explosão de estímulo até que a depressão disseminada seja desencadeada. O limiar de depressão disseminado em lums desencadeia a depressão disseminada a cada nove minutos por uma hora.

Registre cerca de três áreas de potencial rápido e mudanças de potencial lento por meio de sistemas de processamento de sinal digital separados. Após a última depressão de propagação, retorne o inserto de cultura às condições normais de incubação e marque a tampa do prato de cultura. Observar a cultura que experimentou a disseminação da depressão muda de mídia a cada três ou quatro dias até a colheita da cultura.

Inicie este procedimento diluindo a selectina ISO a 20 microgramas por mililitro em meios de cultura. Em seguida, incube culturas de fatias em condições normais de incubação quatro a 10 horas antes da imagem, ligue o microscópio, a câmera, a luz UV, o controle de temperatura e os gases pelo menos uma hora antes da imagem. Em seguida, configure o software metamorfo para geração de imagens, depois coloque a inserção em uma placa de cultura de 35 milímetros com duas hastes de vidro de um milímetro na parte inferior.

Em seguida, coloque três pedaços de dois milímetros de tubo de borracha entre as paredes do inserto e a placa de cultura. Para estabilizar ainda mais a inserção, coloque um pedaço de algodão de 10 milímetros de largura embebido em mais um mililitro de mídia dentro da inserção. Para manter um ambiente umidificado, cubra bem a parte superior da placa de cultura com filme de cloreto de polivinila.

Para evitar a perda de fluido, certifique-se de que o foco da imagem esteja na camada de células parametálicas CA três. Observe a orientação das fatias tirando fotos de fase em cinco x 10 x e 20 x na janela de foco fino, defina a faixa atual como oito e a precisão com um clique, encontre o foco para garantir uma imagem em foco na janela de lapso de tempo de aquisição. Selecione o intervalo de tempo para ser de um minuto e a duração para ser de seis horas para capturar com precisão os movimentos microgliais.

A imagem não deve ser menos frequente do que uma vez por minuto no final do filme. Verifique se há lesão celular por triagem de conversa CY para experimentos de PCR. Mergulhe as inserções de cultura de fatias em dois a três mililitros de RNA posteriormente e armazene-as a quatro graus Celsius por até três dias até o processamento posterior.

Para colher, remova o tecido estranho usando uma faca de vidro, coloque as fatias em RNAs individuais. Tubos de centrífuga de 1,5 mililitro livres de DNAs contendo 0,5 mililitros de solução salina tamponada com fosfato estéril. Usando um pincel de ponta fina, gire amostras, os 10.000 RPM por um minuto de forma estereotipada para que todas as fatias adiram ao mesmo lado de seus tubos.

Remover o sobrenadante PBS e ressuspender a amostra em 500 microlitros de triol. Armazene as amostras a menos 80 graus Celsius ou mantenha-as no gelo até a extração do RNA As alterações na expressão da proteína devido ao knockdown do RNA SI podem ser avaliadas com sensibilidade, aprimorando a imunocoloração DAB tradicional por meio da intensificação da prata e subsequente quantificação métrica de densi. Aqui é mostrado o paradigma de registro eletrofisiológico da cultura de fatias no qual um microeletrodo de gravação é colocado na camada de três neurônios parametálicos CA e um eletrodo estimulante bipolar é colocado no giro denteado.

Aqui está um exemplo dos potenciais de campo CA evocados três por estimulação do giro denteado, que é usado para estabelecer a resposta máxima da metade, aqui mostra as respostas do potencial de campo CA três a rajadas de 10 hertz restantes que foram progressivamente aumentadas em uma intensidade para eventualmente desencadear a depressão que se espalha. No canto inferior direito. Aqui é mostrada uma célula imune vital exemplar.

Esta imagem demonstra pela primeira vez que uma fração da micróglia se move por longas distâncias em um padrão de busca ideal, conforme indicado em vermelho, conhecido como voos de levy, que são inversamente proporcionais à atividade sináptica. A amplificação preem de CDNA permite a detecção de IFN gama em culturas de fatias de hipocampo. Inicialmente, a TC para um gene de referência RPL 13 A era de 20,5 e o IFN gama era indetectável à esquerda.

No entanto, após a amplificação de Preem indicada à direita, o IFN gama foi facilmente detectado em 29,0. Com o RPL 13 A registrando 14,1 para indicar um aumento de 12 vezes na amplificação do sinal, a confirmação imuno-histoquímica de uma eficiência é mostrada aqui. A intensificação diferenciada da prata da imunocoloração de peroxidase diamina benzina é usada para quantificar a redução significativa da produção de ciclofilina B em culturas de fatias de hipocampo tratadas com siRNA Uma vez dominada.

As técnicas descritas neste vídeo podem ser executadas ao longo de vários dias. Desejamos enfatizar que nossas culturas de fatias de hipocampo se aproximam muito de suas contrapartes in vivo e são ideais para estudar a sinalização imunológica e espalhar a depressão. No entanto, é essencial manter o ambiente imunológico quiescente sob controle e condições simuladas.

Para minimizar a ativação imunológica confusa, as culturas devem ser mantidas em condições estéreis. Eles não devem ser expostos a perturbações químicas, mecânicas ou térmicas excessivas. Como a sinalização fisiológica de citocinas ocorre no nível femtomolar, técnicas de medição altamente sensíveis e reprodutíveis devem ser aplicadas.

Usamos a tecnologia PCRA e técnicas proteômicas sensíveis. Finalmente, as citocinas são pleiotrópicas e redundantes. Conformemente. Alvos de citocinas multiplex medidos ao longo do tempo são úteis para estudar como a sinalização imunológica modula a suscetibilidade à entorse, depressão e, por extensão, enxaqueca.