Name: Modelagem Neural Sinalização Imune de migrânea episódica e crônica Usando a depressão alastrante In Vitro /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 13 s
Description: Aprenda a modelar sinalização neuroimune em enxertos de hipocampo de rato para estudar depressão alastrante e susceptibilidade à migrânea. Este método revela alvos terapêuticos inovadores para tratamento da dor de cabeça.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NS-19108), o Instituto Nacional de Saúde Infantil e de Doenças (PO1-HD09402), a Fundação de Pesquisa da enxaqueca e da Fundação White. Ms. Marcia P. Kraig assistida na preparação e manutenção de sistemas de cultura.

<ol><li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+precede+electrophysiological+changes+of+spreading+depression+in+hippocampal+organ+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium waves precede electrophysiological changes of spreading depression in hippocampal organ cultures.</a> J Neurosci. 18 (9), 3416-3425 (1998).</li>
<li>Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+current+source+density+analysis+in+hippocampal+organotypic+culture+shows+that+spreading+depression+occurs+with+uniquely+reversing+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents.</a> J Neurosci. 25 (15), 3952-3961 (2005).</li>
<li>Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+IgG+is+neuroprotective+via+enhancing+microglial+recycling+endocytosis+and+TNF-%CE%B1lpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-αlpha.</a> J Neurosci. 28 (47), 12199-12211 (2008).</li>
<li>Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+in+vitro%3A+analysis+of+morphology+and+adhesion+molecule+expression+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Glia. 18 (4), 319-331 (1996).</li>
<li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+physiology%3A+unique+stimuli%2C+specialized+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).</li>
<li>Mitchell, H. M., White, D. M., Domowicz, M. S., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+pre-conditioning+neuroprotection+depends+on+TNF-%CE%B1lpha+and+is+enhanced+by+blockade+of+interleukin-11%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem+DOI%22%5BJournal%5D)">Cold pre-conditioning neuroprotection depends on TNF-αlpha and is enhanced by blockade of interleukin-11.</a> J Neurochem DOI. , (2010).</li>
<li>Mitchell, H. M., White, D. M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+study+of+neuroprotection+from+cold-preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Strategies for study of neuroprotection from cold-preconditioning.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytosis+from+excitotoxic+injury+in+hippocampal+organ+culture+parallels+that+seen+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 17 (1), 26-43 (1997).</li>
<li>Grinberg, Y. Y., Milton, J. G., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+depression+sends+microglia+on+L%C3%A9vy+flights%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Spreading depression sends microglia on Lévy flights.</a> PLoS ONE. 6 (4), (2011).</li>
<li>Koroleva, V. I., Oitzl, M. S., Bures, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold+of+synaptically+elicited+cortical+spreading+depression%3A+drug-induced+changes+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr+Clin+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Threshold of synaptically elicited cortical spreading depression: drug-induced changes in rats.</a> Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 60 (1), 55-64 (1985).</li>
<li>Gubern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+housekeeping+genes+for+quantitative+real-time+PCR+in+in-vivo+and+in-vitro+models+of+cerebral+ischaemia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Validation of housekeeping genes for quantitative real-time PCR in in-vivo and in-vitro models of cerebral ischaemia.</a> BMC Mol Biol. 10, 57-57 (2009).</li>
<li>Tian, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantification+of+ADAMTS+expression+in+an+animal+model+of+cerebral+ischemia+using+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Anaesthesiol+Scand%22%5BJournal%5D)">The quantification of ADAMTS expression in an animal model of cerebral ischemia using real-time PCR.</a> Acta Anaesthesiol Scand. 51 (2), 158-164 (2007).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29 (9), e45-e45 (2001).</li>
<li>Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+guidelines%3A+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Pusic, A. D., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+gene+micro+array+profiling+demonstrates+%22T-cell-like%22+activation+after+recurrent+spreading+depression+-+implications+for+migraine+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Soc+Neurosci+abst%22%5BJournal%5D)">Inflammatory gene micro array profiling demonstrates "T-cell-like" activation after recurrent spreading depression - implications for migraine pathogenesis.</a> Soc Neurosci abst. , (2010).</li>
<li>Quinn, B., Graybiel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiated+silver+intensification+procedure+for+the+peroxidase-diaminobenzidine+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A differentiated silver intensification procedure for the peroxidase-diaminobenzidine reaction.</a> J Histochem Cytochem. 44 (1), 71-74 (1996).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eicosanoids+and+nitric+oxide+influence+induction+of+reactive+gliosis+from+spreading+depression+in+microglia+but+not+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Eicosanoids and nitric oxide influence induction of reactive gliosis from spreading depression in microglia but not astrocytes.</a> J Comp Neurol. 369 (1), 93-108 (1996).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

SD é uma perturbação paroxística do cérebro cujas características são altamente conservada em todas as regiões do cérebro examinado espécies e até à data. SD é comumente estudada em neocórtex. No entanto, a complexidade do circuito neural desta estrutura (em comparação com o hipocampo), bem como a incapacidade de manter viva neocórtex in vitro com funções imunológicas de repouso por períodos prolongados, torná-lo menos útil como uma preparação em vitro para a definição das consequências a longo prazo de susceptibilidade SD. Em contraste, o hipocampo não é apenas a estrutura do cérebro que é mais sensível a SD, é também uma estrutura archicortical com uma estrutura mais simplificada do circuito neural e função, que é bem adequado para definir os meios pelos quais neuroimunes atividade neural pode modular a suscetibilidade SD .

modelagem neural sinalização imune de migrânea episódica e crônica usando a depressão alastrante in vitro</em

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

Enxaqueca e sua transformação para enxaqueca crônica são encargos de saúde que precisam de opções de tratamento melhoraram. Procuramos definir como sinalização imune neural modula a suscetibilidade à enxaqueca, como modelo in vitro utilizando a depressão alastrante (SD), como um meio para desenvolver novos alvos terapêuticos para enxaqueca episódica e crônica. SD é a causa provável de aura de enxaqueca e dor da enxaqueca. É uma perda da função neuronal paroxística desencadeada por aumento da atividade neuronal, inicialmente, que lentamente se propaga dentro de regiões cerebrais suscetíveis. Função normal do cérebro é extremamente sensível a, e se baseia em, coincidente baixo nível de sinalização imune. Assim, a sinalização neural imunológico provavelmente afeta a atividade elétrica do SD, e, portanto, enxaqueca. Estudos percepção de dor em animais inteiros SD são repletas de dificuldades, mas os animais inteiros são adequados para examinar os aspectos biologia de sistemas de enxaqueca desde SD ativa trigeminal vias nociceptivas. No entanto, estudos com animais inteiros por si só não pode ser usado para decifrar os mecanismos celulares e circuitos neurais da SD. Em vez disso, em preparações in vitro, onde as condições ambientais podem ser controlados são necessários. Aqui, é importante reconhecer as limitações de fatias aguda e vantagens distintas das culturas fatia do hipocampo. Fatias de cérebro agudo não pode revelar mudanças sutis na sinalização imune desde a preparar as fatias sozinho dispara: pró-inflamatórias mudanças que nos últimos dias, o comportamento epileptiforme devido aos altos níveis de tensão de oxigênio necessário para vitalizar as fatias, e lesões celulares irreversíveis nos centros fatia anóxica. Em contraste, nós examinamos sinalização imunológico maduro em culturas fatia hipocampal desde a culturas intimamente paralelo, a sua contrapartida na vivo com a função trisynaptic madura; mostrar astrócitos quiescente, microglia e os níveis de citocinas, e SD é facilmente induzida em uma preparação não anestesiados. Além disso, as fatias são de longa duração e SD pode ser induzida em dias consecutivos sem lesão, fazendo esta preparação o único meio de data-capazes de modelar as conseqüências de doenças crônicas neuroimunes SD, e enxaqueca crônica, assim, talvez. Usamos técnicas eletrofisiológicas e não-invasivo para medir a imagem de células neuronais e as funções de circuito coincidente com SD. Neural variáveis ​​expressão imune gene são medidos com qPCR triagem, arrays qPCR, e, mais importante, o uso de pré-amplificação de cDNA para detecção de alvos ultra-baixo nível, como interferon-gama usando todo, regionais ou específicos de células avançado (via laser microscopia de dissecção) amostragem. Sinalização em cascata de citocinas é avaliada com metas fosfoproteína multiplexados relacionadas com a expressão de genes e alterações fosfoproteína confirmada através de células específicas de imunocoloração. Estratégias farmacológicas e siRNA são utilizados para imitar e modular de sinalização imune SD.

Enxaqueca e sua transformação para enxaqueca crônica são um fardo imenso de saúde que precisam de opções de tratamento melhoraram. Procuramos definir como sinalização imune neural modula a suscetibilidade à enxaqueca, modelada<em&gt; In vitro</em&gt; Usando a depressão alastrante em culturas fatia do hipocampo, como um meio para desenvolver novos alvos terapêuticos.

Modelagem Neural Sinalização Imune de migrânea episódica e crônica Usando a depressão alastrante In Vitro</em

Migraine and its transformation to chronic migraine are healthcare burdens in need of improved treatment options.  We seek to define how neural immune ...

O objetivo deste vídeo é ilustrar como as culturas de fatias de hipocampo podem ser usadas para decifrar a sinalização imunológica neural que modula a suscetibilidade à propagação da depressão, a causa subjacente mais provável da aura da enxaqueca e talvez da enxaqueca. A depressão disseminada é facilmente evocada em culturas de fatias do hipocampo. Como as culturas são mantidas in vitro por semanas, o comportamento de tipos de células individuais pode ser medido, imitado e modulado por longos períodos.Isso é especialmente importante para o estudo da sinalização imunológica neural. Como as fatias do cérebro do hipocampo maduro atingem um estado imunológico quiescente, as respostas imunes da depressão disseminada podem ser avaliadas sem os efeitos potencialmente confusos da anestesia usando técnicas modernas de biologia molecular. A detecção sensível de citocinas sinalizando de apenas 50 células a aproximadamente 90.000 células em uma fatia pode ser determinada de acordo.As culturas de fatias de cérebro do hipocampo são ideais para uso no desenvolvimento de novas terapias imunes neurais para aliviar a enxaqueca. Meu nome é Yian Berg e aqui é Aya Puss e Heidi Mitchell do laboratório de Richard Craig e do Departamento de Neurologia do Centro Médico da Universidade de Chicago. Hoje vamos demonstrar o uso de hipocampo de rato, piolhos, culturas e o estudo da sinalização imunológica de baixo nível da depressão disseminada.A depressão disseminada é um evento neural paroxístico que é desencadeado por uma explosão de aumento da atividade sináptica que é rapidamente seguida por uma perda transitória de toda a atividade. Evidências crescentes mostram que a sinalização imunológica de baixo nível pode influenciar e, em troca, ser influenciada pela atividade sináptica dentro do cérebro. Nossa hipótese é que as citocinas modulam a suscetibilidade à propagação da depressão e, como resultado, a aura da enxaqueca e talvez a enxaqueca também.Os procedimentos que descrevemos aqui são projetados para minimizar a ativação de células imunes potencialmente confusas e aumentar nossa capacidade de detectar sinalização imunológica de baixo nível. Isso nos permite detectar a mais ampla gama de sinalização imunológica neural e suas interações com a propagação da depressão. Para iniciar este procedimento, faça eletrodos de aterramento cortando tubos de vidro em comprimentos de 4,5 milímetros.Em seguida, polir brevemente as seções cortadas em ambas as extremidades. Em seguida, leve 100 mililitros de cloreto de potássio molar para ferver, adicione 3,5 gramas de ágar e 0,5 gramas de EDTA. Mexa a mistura continuamente para obter uma solução amarela clara.Encaixe um pedaço de tubo flexível curto sobre cada tubo de vidro. Em seguida, puxe a solução agrícola de cloreto de potássio quente para o tubo de vidro e a uma curta distância para o tubo flexível. Solte a sucção e deixe o ágar cloreto de potássio escorrer lentamente da ponta aberta do tubo de vidro.À medida que o ágar-ágar escorre, toque em um pedaço de gelo com a ponta do tubo de vidro aberto, o que fará com que o ágar-ágar gelifique na ponta do eletrodo e não gelifique depois de recuar de volta para o tubo de vidro. Assim que o ágar-ágar estiver gelatinoso, remova suavemente o tubo flexível sem alterar a posição do ágar. Nos tubos de vidro, coloque 0,5 mililitros de cloreto de potássio molar em cada poço de um rack de tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.Em seguida, coloque a ponta de cada tubo de vidro de cloreto de potássio em poços individuais para manter as pontas úmidas. Em seguida, segure um fio de prata calibre 80 centímetros de comprimento 15 com um hemostático. Limpe cada um dos quatro lados raspando o fio através de uma lixa presa à bancada.Depois disso, corte o fio em comprimentos de quatro centímetros. Coloque-os em um frasco de cintilação cheio de água sanitária por 20 a 30 minutos. Para colocar uma camada firme de prata a cloreto de prata sobre a superfície de prata limpa, dobre o fio ao meio e insira-o no tubo de vidro cheio de ágar cloreto de potássio, deixando cerca de quatro a seis milímetros expostos.Em seguida, cubra a ponta do tubo de vidro contendo o fio de prata e uma pequena extensão do fio com gosma, uma cola resistente à água e flexível para evitar que o ágar cloreto de potássio seque, repita para todos os eletrodos e deixe a cola secar durante a noite. Após a coleta, armazene os eletrodos em frascos de cintilação com cinco mililitros de cloreto de potássio molar e 25 miligramas de EDTA. Cerca de cinco a seis eletrodos por frasco a quatro graus Celsius.Faça eletrodos de gravação com tubos de vidro de silicato bo com filamentos. Em seguida, faça um eletrodo estimulante cortando cerca de 20 centímetros de comprimento de merídio de platina revestido de Teflon. Em seguida, dobre o comprimento ao meio, amarre as pontas soltas em um nó quadrado solto, deixando cerca de dois centímetros do nó até as pontas do fio.Prenda o nó no mandril de uma furadeira elétrica colocada sobre uma mesa enquanto segura a outra extremidade do fio com um hemostático. Ligue e desligue brevemente a furadeira até que o fio esteja bem torcido. Para prender os fios torcidos de merídio de platina aos fios condutores, primeiro prenda o fio torcido de merídio de platina em uma bancada e solte uma poça de ácido clorídrico concentrado sobre uma extremidade livre do fio trançado.Em seguida, coloque a extremidade descascada em um fio condutor adjacente à extremidade do fio torcido e aplique calor de um ferro de solda de ponta fina e solde até que os dois fios estejam firmemente presos. Deslize um pequeno pedaço de tubo termorretrátil sobre a conexão do fio exposto e encolha-o com fogo térmico. Polir a ponta de uma pipeta de 15 centímetros e guiar o fio do meridiano de platina torcido pela pipeta.Use um epóxi repelente de água para selar ambas as extremidades do eletrodo. Finalmente, conecte plugues banana às extremidades do fio condutor para a conexão ao isolador de estímulo sob observação estereoscópica. Coloque a ponta do eletrodo em PBS e procure bolhas produzidas eletrolíticas provenientes apenas da extremidade cortada das pontas dos eletrodos, se houver bolhas nas laterais dos fios trançados.Corte o eletrodo transversalmente usando uma lâmina de barbear de borda única para restabelecer o isolamento intacto dos eixos longos dos fios. Ao solucionar problemas para resolver efeitos de estímulo aberrantes, tente fazer uma ponta de eletrodo recém-cortada. Outra etapa importante é preparar as placas de gravação, que consistem em uma inserção de cultura de fatias e uma placa de cultura de 35 milímetros que fica em duas hastes de vidro de 1,0 x 12 milímetros espaçadas cerca de 1,0 centímetros de distância.As hastes de vidro são fixadas à base do prato aquecendo os tubos de vidro e, em seguida, pressionando-os na base com uma pinça. Para condições de gravação estática, adicione 1,5 mililitros de mídia ao prato. Em seguida, mergulhe um pedaço de algodão estéril com 10 milímetros de largura e três a quatro centímetros de comprimento.Em 1,0 mililitros de mídia, dobre o algodão ao meio ao longo do eixo longo e coloque-o ao longo da parede interna do inserto. Com pinça estéril, o algodão úmido ajuda a manter a umidade do prato. Três pedaços de tubo compressíveis de quatro milímetros de comprimento são igualmente espaçados ao redor do inserto.Cubra bem o prato com filme de cloreto de polivinila para permitir a troca gasosa. Em seguida, corte ao redor da parede vertical média com uma lâmina de barbear de borda única para remover o excesso de cloreto de polivinila. O filme evoca um potencial de campo de três com pulsos de 100 microssegundos a 0,2 hertz, começando com uma corrente de cerca de um a cinco microamperes que é suficiente para desencadear uma resposta.Mova o eletrodo de registro em incrementos ao longo do eixo longo do neurônio parametálico até que o potencial de campo seja máximo. Em seguida, aumente a corrente com um eletrodo de gravação nesta posição e observe a resposta máxima da corrente de cerca de 10 a 20 micro amperes. Finalmente, use metade da intensidade máxima do estímulo para experimentos para determinar o limiar para depressão disseminada evocada transsinapticamente.Mude o paradigma de estimulação para evocar manualmente rajadas únicas de 100 microssegundos por pulso a 10 hertz. Aumente progressivamente a intensidade da corrente por explosão de estímulo até que a depressão disseminada seja desencadeada. O limiar de depressão disseminado em lums desencadeia a depressão disseminada a cada nove minutos por uma hora.Registre cerca de três áreas de potencial rápido e mudanças de potencial lento por meio de sistemas de processamento de sinal digital separados. Após a última depressão de propagação, retorne o inserto de cultura às condições normais de incubação e marque a tampa do prato de cultura. Observar a cultura que experimentou a disseminação da depressão muda de mídia a cada três ou quatro dias até a colheita da cultura.Inicie este procedimento diluindo a selectina ISO a 20 microgramas por mililitro em meios de cultura. Em seguida, incube culturas de fatias em condições normais de incubação quatro a 10 horas antes da imagem, ligue o microscópio, a câmera, a luz UV, o controle de temperatura e os gases pelo menos uma hora antes da imagem. Em seguida, configure o software metamorfo para geração de imagens, depois coloque a inserção em uma placa de cultura de 35 milímetros com duas hastes de vidro de um milímetro na parte inferior.Em seguida, coloque três pedaços de dois milímetros de tubo de borracha entre as paredes do inserto e a placa de cultura. Para estabilizar ainda mais a inserção, coloque um pedaço de algodão de 10 milímetros de largura embebido em mais um mililitro de mídia dentro da inserção. Para manter um ambiente umidificado, cubra bem a parte superior da placa de cultura com filme de cloreto de polivinila.Para evitar a perda de fluido, certifique-se de que o foco da imagem esteja na camada de células parametálicas CA três. Observe a orientação das fatias tirando fotos de fase em cinco x 10 x e 20 x na janela de foco fino, defina a faixa atual como oito e a precisão com um clique, encontre o foco para garantir uma imagem em foco na janela de lapso de tempo de aquisição. Selecione o intervalo de tempo para ser de um minuto e a duração para ser de seis horas para capturar com precisão os movimentos microgliais.A imagem não deve ser menos frequente do que uma vez por minuto no final do filme. Verifique se há lesão celular por triagem de conversa CY para experimentos de PCR. Mergulhe as inserções de cultura de fatias em dois a três mililitros de RNA posteriormente e armazene-as a quatro graus Celsius por até três dias até o processamento posterior.Para colher, remova o tecido estranho usando uma faca de vidro, coloque as fatias em RNAs individuais. Tubos de centrífuga de 1,5 mililitro livres de DNAs contendo 0,5 mililitros de solução salina tamponada com fosfato estéril. Usando um pincel de ponta fina, gire amostras, os 10.000 RPM por um minuto de forma estereotipada para que todas as fatias adiram ao mesmo lado de seus tubos.Remover o sobrenadante PBS e ressuspender a amostra em 500 microlitros de triol. Armazene as amostras a menos 80 graus Celsius ou mantenha-as no gelo até a extração do RNA As alterações na expressão da proteína devido ao knockdown do RNA SI podem ser avaliadas com sensibilidade, aprimorando a imunocoloração DAB tradicional por meio da intensificação da prata e subsequente quantificação métrica de densi. Aqui é mostrado o paradigma de registro eletrofisiológico da cultura de fatias no qual um microeletrodo de gravação é colocado na camada de três neurônios parametálicos CA e um eletrodo estimulante bipolar é colocado no giro denteado.Aqui está um exemplo dos potenciais de campo CA evocados três por estimulação do giro denteado, que é usado para estabelecer a resposta máxima da metade, aqui mostra as respostas do potencial de campo CA três a rajadas de 10 hertz restantes que foram progressivamente aumentadas em uma intensidade para eventualmente desencadear a depressão que se espalha. No canto inferior direito. Aqui é mostrada uma célula imune vital exemplar.Esta imagem demonstra pela primeira vez que uma fração da micróglia se move por longas distâncias em um padrão de busca ideal, conforme indicado em vermelho, conhecido como voos de levy, que são inversamente proporcionais à atividade sináptica. A amplificação preem de CDNA permite a detecção de IFN gama em culturas de fatias de hipocampo. Inicialmente, a TC para um gene de referência RPL 13 A era de 20,5 e o IFN gama era indetectável à esquerda.No entanto, após a amplificação de Preem indicada à direita, o IFN gama foi facilmente detectado em 29,0. Com o RPL 13 A registrando 14,1 para indicar um aumento de 12 vezes na amplificação do sinal, a confirmação imuno-histoquímica de uma eficiência é mostrada aqui. A intensificação diferenciada da prata da imunocoloração de peroxidase diamina benzina é usada para quantificar a redução significativa da produção de ciclofilina B em culturas de fatias de hipocampo tratadas com siRNA Uma vez dominada.As técnicas descritas neste vídeo podem ser executadas ao longo de vários dias. Desejamos enfatizar que nossas culturas de fatias de hipocampo se aproximam muito de suas contrapartes in vivo e são ideais para estudar a sinalização imunológica e espalhar a depressão. No entanto, é essencial manter o ambiente imunológico quiescente sob controle e condições simuladas.Para minimizar a ativação imunológica confusa, as culturas devem ser mantidas em condições estéreis. Eles não devem ser expostos a perturbações químicas, mecânicas ou térmicas excessivas. Como a sinalização fisiológica de citocinas ocorre no nível femtomolar, técnicas de medição altamente sensíveis e reprodutíveis devem ser aplicadas.Usamos a tecnologia PCRA e técnicas proteômicas sensíveis. Finalmente, as citocinas são pleiotrópicas e redundantes. Conformemente. Alvos de citocinas multiplex medidos ao longo do tempo são úteis para estudar como a sinalização imunológica modula a suscetibilidade à entorse, depressão e, por extensão, enxaqueca.

modeling-neural-immune-signaling-episodic-chronic-migraine-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Neste estudo, os autores relatam pela primeira vez um 3D imersivo e interativo neuronavegação (3D-IIN), através do impacto de um ataque de enxaqueca dor de cabeça espontânea no sistema μ-opióides do cérebro de um paciente in vivo romance.

3D-neuronavegação<em&gt; In Vivo</em&gt; Através do cérebro de um paciente durante uma espontânea enxaquecas

Este manuscrito descreve os métodos de indução e pontuação do modelo experimental de encefalomielite autoimune (EAE), juntamente com a avaliação da distribuição de células imunes e níveis de citocinas de mRNA em linfonodos, baço, sangue e medula espinhal usando citometria de fluxo e PCR quantitativo, respectivamente, em várias fases da doença.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em camundongos e avaliação da distribuição da doença dependente de células imunes em vários tecidos

Aqui, apresentamos os protocolos para investigar o comprometimento da unidade neurovascular durante encefalomielite auto-imune experimental in vivo. Abordamos especificamente como determinar a permeabilidade da barreira hemato - encefálica e gelatinase atividade envolvida na migração de leucócitos através da limitans da glia.

Visualizando o comprometimento das barreiras endoteliais e Glial da unidade Neurovascular durante encefalomielite auto-imune Experimental In Vivo

Roedores não são capazes de relatar sintomas de enxaqueca. Aqui, descrevemos um paradigma de teste gerenciável (ensaios de campo claro/escuro e aberto) para medir a aversão à luz, um dos sintomas mais comuns e incômodos em pacientes com enxaquecas.

Investigando comportamento semelhante à enxaqueca usando aversão à luz em camundongos

O sintoma mais notável da enxaqueca é a dor severa na cabeça, e é supor que isso é mediado por neurônios sensoriais que inervam as meninges. Aqui, apresentamos um método para aplicar localmente substâncias à dura de forma minimamente invasiva ao usar a hipersensibilidade facial como saída.

Estimulação dural e teste periorbital von Frey em camundongos como um modelo pré-clínico de dor de cabeça

O presente protocolo descreve a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo utilizando glicoproteína de oligodendrócitos de mielina e monitorando o processo da doença usando um sistema de pontuação clínica. Os sintomas experimentais relacionados à encefalomielite autoimune são analisados usando tomografia microcomputadorizada de fêmur de camundongo e teste de campo aberto para avaliar o processo da doença de forma abrangente.

Indução e Diversos Indicadores de Avaliação da Encefalomielite Autoimune Experimental

O presente protocolo descreve uma injeção de dois pontos de linfosfatilcolina através de um quadro estereotaxico para gerar um modelo de desmielinização estável e reprodutível em camundongos.

Uma injeção de dois pontos estabelecida stably de lysophosphatidylcoline-Induced Focal Demyelination Modelo em camundongos

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) serve como modelo animal de esclerose múltipla. Este artigo descreve uma abordagem para pontuar inflamação medular, desmielinização e lesão axonal em EAE. Adicionalmente, um método para quantificar os níveis de luz solúvel dos neurofilamentos no soro de camundongos é apresentado, facilitando a avaliação da lesão axonal em camundongos vivos.

Pontuação de Inflamação, Desmielinização e Lesão do Axônio do Sistema Nervoso Central na Encefalomielite Autoimune Experimental

A encefalomielite autoimune experimental é um dos modelos murinos de esclerose múltipla mais utilizados. No protocolo atual, camundongos C57BL/6J de ambos os sexos são imunizados com peptídeo glicoproteico oligodendrócito de mielina, resultando principalmente em paresia ascendente da cauda e membros. Aqui discutimos o protocolo de indução e avaliação da EAE.

Modelagem da Esclerose Múltipla em Dois Sexos: Encefalomielite Autoimune Experimental Induzida por MOG35-55

Este protocolo demonstra a combinação de imagem e eletrofisiologia para detectar de forma confiável despolarizações disseminadas em camundongos adultos após uma lesão cerebral traumática leve.

Combinando imagem e eletrofisiologia para visualizar e registrar despolarizações de propagação em camundongos

Este protocolo fornece um método para rastrear o estrabismo ocular automatizado em roedores ao longo do tempo de maneira compatível com o bloqueio de tempo para medidas neurofisiológicas. Espera-se que este protocolo seja útil para pesquisadores que estudam mecanismos de distúrbios dolorosos, como a enxaqueca.

Um método automatizado de estrabismo para comportamento de sincronização de tempo e dinâmica cerebral em estudos de dor em camundongos

Aprenda a modelar sinalização neuroimune em enxertos de hipocampo de rato para estudar depressão alastrante e susceptibilidade à migrânea. Este método revela alvos terapêuticos inovadores para tratamento da dor de cabeça.

Modelagem Neural Sinalização Imune de migrânea episódica e crônica Usando a depressão alastrante In Vitro

Explorar mais vídeos