A High Throughput In situ Método de hibridização para caracterizar padrões de expressão de mRNA no Rato Fetal Trato urogenital inferior

O objetivo geral deste procedimento é visualizar os padrões de expressão de mRNA em tecidos em desenvolvimento do trato urogenital inferior de camundongos fetais. Isso é realizado primeiramente sintetizando uma sonda ribonucleotídica marcada com digoxigenina a partir de um molde gerado por PCR. O segundo passo do procedimento consiste em gerar cortes espessos utilizando um microtomo vibratório.

O terceiro passo é realizar uma hibridização in situ em seções do trato urogenital inferior contidas em cestos personalizados. Os RNAm são visualizados por meio da detecção imuno-histoquímica de sondas de riboprobes ligadas, utilizando o substrato de fosfatase alcalina BM purple que forma precipitado. Em última análise, a microscopia pode mostrar a localização espacial e temporal de transcritos de RNAm de baixa e alta abundância no trato urogenital inferior fetal de camundongo.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a imuno-histoquímica, é que as sondas de RNA são fáceis de gerar e podem ser produzidas para reconhecer a maioria dos RNAs mensageiros em todo o genoma do camundongo. Embora este método forneça informações sobre os padrões de expressão de RNA mensageiro durante o desenvolvimento geniturinário fetal do camundongo, ele também pode ser aplicado a outros sistemas orgânicos, espécies e estágios de desenvolvimento. A demonstração visual deste método é essencial, pois o encapsulamento do tecido em agárose pode ser difícil de aprender, e pequenas variações na orientação podem levar a resultados inconsistentes. Pelo menos um dia antes de preparar o tecido, remova e descarte a membrana de uma placa de cultura celular millicell com diâmetro de 12 milímetros, enquanto o anel restante funcionará como um molde; deixe os anéis embebidos durante a noite em solução inibidora de RNAses.

No dia do protocolo, dissecar o trato urogenital inferior de um camundongo que tenha sido reidratado com metanol em concentrações graduais. Após lavagens com PBS contendo tween, descartar aproximadamente dois terços da bexiga e armazenar o tecido restante do trato urogenital inferior em PBS com tween. Em seguida, colocar um molde de anel tratado sobre uma lâmina de microscópio de vidro e preenchê-lo com uma solução de agarose de baixo ponto de fusão a 4% à temperatura de 62 graus Celsius, deixando esfriar por cerca de dois minutos.

Agora, seque o tecido do trato urogenital inferior e submerja-o na solução de agarose. Use pinças para orientar o tecido de modo que ele fique suspenso na metade da distância entre a parte superior e inferior do anel. Incube na moldagem a quatro graus Celsius até que a agarose tenha solidificado.

Antes de cortar o tecido, prepare uma lâmina Wilkinson personalizada lavando-a com solventes, seguido por água. Separe o comprimento da lâmina dupla no sentido longitudinal em duas lâminas simples. Em seguida, apoie a lâmina Wilkinson com uma lâmina de micrótomo.

Para fazer isso primeiramente, corte a lâmina de micrótomo ao comprimento da lâmina Wilkinson. Em seguida, usando um adesivo Lock Tite, cole a lâmina de micrótomo à lâmina Wilkinson com um deslocamento de cerca de três a quatro milímetros em relação à borda de corte. Agora, monte a lâmina reforçada no micrótomo vibratório e ajuste o ângulo da lâmina para 35 graus.

Prepare o banho de espécime de luxo enchendo-o com PBS e colocando gelo úmido ao redor. Antes de montar o tecido embutido no tampão, remova-o do molde anelar e seque a superfície inferior. Em seguida, cole a superfície seca ao disco de montagem usando adesivo Loctite.

Insira o disco no vibrátomo e ajuste a espessura da seção para 50 micrômetros, a velocidade para dois e a amplitude da lâmina para quatro. Durante o corte das seções de tecido, use pinça romba para transferir cada seção para uma placa de cultura de 24 poços contendo meio mililitro de PBS tween gelado. Após o corte, remova a maior parte do aros ao redor de cada seção de tecido usando tesoura de mola antes de iniciar a hibridização INI; as seções podem ser armazenadas por até 48 horas a quatro graus Celsius em PBS tween contendo azida de sódio 2 milimolar.

Primeiro, prepare cestos personalizados para amostras cortando o fundo de um tubo de microcentrífuga na marca de 100 microlitros. Aqueça o corte do tubo em uma chama até que o plástico fique macio. Em seguida, pressione firmemente o plástico macio sobre um quadrado de malha.

Deixe endurecer e corte o excesso de malha. Complete as cestas usando uma agulha aquecida de calibre 18 para perfurar dois orifícios em cada tampa de tubo. Faça uma bandeja para acomodar as cestas de amostra perfurando 24 orifícios de 12 milímetros igualmente espaçados na tampa de uma placa de 24 poços.

Cada poço deve ser posicionado diretamente sobre um poço antes de iniciar o pré-aquecimento de uma câmara de hibridização tampada, preenchida com meio centímetro de água da torneira a 60,5 graus Celsius. Inicie a hibridização in situ adicionando dois mililitros de PBS tween a cada poço da placa de cultivo de 24 poços. Tampe esta placa com a tampa preparada, carregada com cestos.

Agora, transfira as seções de tecido para as cestas em temperatura ambiente com agitação, incubando as seções em peróxido de hidrogênio a 6% com PBS tween, seguido por uma série de lavagens com PBS tween, uma incubação com proteinase K, outra fixação e mais lavagens. Para finalizar o preparo das amostras, adicione dois mililitros do tampão de pré-hibridização pré-aquecido a cada poço e incube a placa dentro da câmara de hibridização aquecida por pelo menos uma hora. Inicie a hibridização adicionando 0,5 microgramas da sonda RIBA marcada a cada poço.

Bem, então continue a incubação durante a noite dentro da câmara de hibridização aquecida. No dia seguinte, lave os tecidos com a solução um, mudando gradualmente para a solução dois, depois trate com RNAs. Em seguida, lave na solução três, seguido por lavagens em TBS tween e tampão de bloqueio de tecidos, enquanto os tecidos estão incubando no tampão de bloqueio de tecidos.

Inicie uma incubação de no mínimo duas horas do anticorpo anti-dig no tampão de absorção de anticorpos a quatro graus Celsius após o período de incubação. Centrifugue a solução de anticorpo a 10.000 RPM durante um minuto. Para remover insolúveis, adicione a Senna a dois mililitros de solução de anticorpo tampão.

Agora remova o tecido do tampão de bloqueio e incube-os na solução de anticorpo preparada. Mantenha-os em uma câmara de hibridização durante a noite a quatro graus Celsius no terceiro dia do procedimento. Lave os tecidos várias vezes em TBST com o ole.

Em seguida, utilizando uma pipeta de vidro para pasta. Transfira cuidadosamente os tecidos para tubos de microcentrífuga limpos. Lave os tecidos por 10 minutos com um mililitro de NTM vazio.

Em seguida, substitua a solução por TMT contendo lava sole MBM roxo. Coloque os tubos no escuro e, ao longo dos próximos dias, acompanhe o desenvolvimento da coloração e troque a solução conforme necessário. Após o completo desenvolvimento da coloração, lave brevemente os tecidos com TMT contendo lava so e, então, incube-os durante a noite a quatro graus Celsius em PBS contendo paraformaldeído.

No dia seguinte, descorifique e lave os tecidos. As seções estão agora prontas para a obtenção de imagens. O tecido do trato urogenital inferior foi embutido em ágar de modo que a linha média uretral ficasse paralela à superfície plana do tampão de ágar.

Essa orientação produziu seções sagitais. Cestos para amostras feitos sob medida protegeram as seções de tecido delicadas contra poeira e partículas. Durante o procedimento de hibridização em duas etapas realizado ao longo de vários dias em C.

Eles também evitaram a perda de quaisquer seções. É desafiador limitar a coloração de fundo durante as longas incubações necessárias para detectar RNAm de baixa abundância. No entanto, a adição de azida de sódio e a subsequente filtração parecem ter limitado a coloração de fundo.

Além disso, não houve diferenças visíveis na coloração de fundo quando as amostras foram incubadas na solução de desenvolvimento da coloração por períodos prolongados. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em seis dias se for realizada corretamente. Após este procedimento, outros métodos como imunohistoquímica podem ser realizados para determinar se o padrão de expressão de RNAm se correlaciona com o padrão de expressão da proteína.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como visualizar os padrões de expressão de mRNA e o trato genital inferior em desenvolvimento do camundongo.