Name: A High Throughput In situ Método de hibridização para caracterizar padrões de expressão de mRNA no Rato Fetal Trato urogenital inferior (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprenda hibridização in situ em alta vazão para visualizar padrões de expressão de mRNA no trato urogenital inferior fetal de camundongo. Este método eficiente permite estudar a localização espacial e temporal de transcritos em biologia do desenvolvimento.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Lan Yi, Cancer Institute de Nova Jersey, para assistência técnica na preparação de cestas de tecido. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Grants Saúde DK083425 e DK070219.

<ol><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+possible+influence+of+temporal+factors+in+androgenic+responsiveness+of+urogenital+tissue+recombinants+from+wild-type+and+androgen-insensitive+%28Tfm%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice.</a> Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal%2C+cellular%2C+and+molecular+regulation+of+normal+and+neoplastic+prostatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development.</a> Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).</li>
<li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+development+and+structure+in+the+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22National+Cancer+Institute+Monographs%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of development and structure in the prostate.</a> National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+%28Tfm%2Fy%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).</li>
<li>Rozen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).</li>
<li>Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).</li>
<li>Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dioxin+causes+ventral+prostate+agenesis+by+disrupting+dorsoventral+patterning+in+developing+mouse+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate.</a> Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Usando o método descrito aqui, é possível detectar mRNAs em todos os principais tipos de células e dos compartimentos de tecido fetal do rato LUTs masculino e feminino, incluindo as almofadas mesenquimais, urotélio, o músculo liso, botões da próstata, ducto ejaculatório, e vagina. As seções 50 ìm utilizado neste protocolo tem a vantagem de ser grossa o suficiente para resolver arquitetura do tecido (como vasos sanguíneos), mas são finas o suficiente para evitar armadilhas sonda, que é um problema metodológico comumente ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Anticorpo anti-digoxigenina, fragmentos Fab </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11214667001 </td></tr><tr><td> Bloqueio reagente </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11096176001 </td></tr><tr><td> BM Roxo substrato AP, precipitando </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11442074001 </td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td></tr><tr><td> Placa de cultura de células, 24 bem </td><td> Corning </td><td> 3524 </td></tr><tr><td> Digoxigenina 11 UTP </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073910 </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11969064001 </td></tr><tr><td> De dois gumes lâmina de barbear </td><td> Wilkinson Sword </td><td> Modelo clássico </td></tr><tr><td> Eliminase removedor de RNase </td><td> Decon Laboratories </td><td> 1102 </td></tr><tr><td> Formamida </td><td> Sigma </td><td> F5786-1L </td></tr><tr><td> Gel kit de extração </td><td> Qiagen </td><td> 28704 </td></tr><tr><td> Solução de glutaraldeído, 25% em H 2 O </td><td> Sigma </td><td> G6257-100ML </td></tr><tr><td> Heparina, sal de sódio </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td></tr><tr><td> Solução de peróxido de hidrogênio, 30% em H 2 O </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td></tr><tr><td> Levamisol </td><td> Sigma </td><td> L9756 </td></tr><tr><td> Loctite 404 adesivo instantâneo rápida set </td><td> Henkel Corp </td><td> 46551 </td></tr><tr><td> Cloreto de magnésio </td><td> Fisher Scientific </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> Ácido maleico </td><td> Sigma </td><td> M0375-500G </td></tr><tr><td> Tubos de microcentrífuga, 1,5 ml </td><td> Biologix Empresa de Pesquisa </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Millicell inserir placa de cultura </td><td> Millipore </td><td> PICM01250 </td></tr><tr><td> Resina de moagem Molecular </td><td> G-Biosciences </td><td> 786-138PR </td></tr><tr><td> Solução de paraformaldeído, 4% em tampão fosfato salino </td><td> Affymetrix </td><td> 19943 </td></tr><tr><td> Tampão fosfato salino, sem Ca e Mg </td><td> Biomedicals MP </td><td> ICN1760420 </td></tr><tr><td> Polyester mesh, 33 micron, 12 &quot;x 24&quot; </td><td> Peças pequenas Inc </td><td> CMY-0033-D </td></tr><tr><td> Proteinase K solução, 20mg/ml </td><td> Amresco </td><td> E195-5mL </td></tr><tr><td> Colunas QIAshredder </td><td> Qiagen </td><td> 79654 </td></tr><tr><td> Solução Q </td><td> Qiagen </td><td> Fornecido com Taq DNA polimerase </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma </td><td> R6513 </td></tr><tr><td> RNase inibidor </td><td> Roche Applied Science </td><td> 03335399001 </td></tr><tr><td> RNeasy mini-kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RNEASY mini-kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RQ1 RNase DNase </td><td> Promega </td><td> M6101 </td></tr><tr><td> SeaPlaque baixo-melt agarose </td><td> Lonza </td><td> 50101 </td></tr><tr><td> Soro de ovelha </td><td> Sigma </td><td> S2263-500mL </td></tr><tr><td> Stericup unidade de filtro, 0.22μm, polietersulfona, 500mL </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> Azida de sódio, granular </td><td> Fisher Scientific </td><td> S227I-100 </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP358-212 </td></tr><tr><td> Dodecilsulfato de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529-500 </td></tr><tr><td> SSC, 20X solução </td><td> Research Products International </td><td> S24022-4.000,0 </td></tr><tr><td> SuperScript III sistema de síntese de primeira fita </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> T7 RNA polimerase </td><td> Roche Applied Science </td><td> 10881767001 </td></tr><tr><td> Taq DNA polimerase </td><td> Qiagen </td><td> 201203 </td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP153-1 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Vibrando com micrótomo deluxe banho espécime </td><td> Leica Microsystems </td><td> VT1000A </td></tr><tr><td> Levedura tRNA </td><td> Roche Applied Science </td><td> 109495 </td></tr></tbody></table>

a high throughput in situ método de hibridização para caracterizar padrões de expressão de mrna no rato fetal trato urogenital inferior

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Desenvolvimento do trato urogenital (LUT) é um processo complexo. Essa complexidade é evidenciada durante a formação da próstata a partir da uretra fetal masculino, que se baseia em sinais androgênicos e epitelial-mesenquimal 1,2 interações. Compreensão dos mecanismos moleculares responsáveis ​​pelo desenvolvimento da próstata pode revelar os mecanismos de crescimento que são inadequadamente despertado mais tarde na vida para dar origem a doenças da próstata como a hiperplasia prostática benigna e câncer de próstata. A LUT desenvolvimento é anatomicamente complexa. Pelo tempo de brotamento da próstata começa na concepção pós 16,5 dias (DPC), numerosos tipos de células estão presentes. Vasculatura, nervos e músculos lisos residir no estroma mesenquimal 3. Este estroma envolve um epitélio multicamada e dá origem à próstata fetal através de receptor de andrógeno-dependentes sinais parácrinos 4. A identidade do receptor de andrógeno estroma-responsive genes necessários para a próstata desenvolvimento eo mecanismo pelo qual as formas de próstata epitélio ductal em resposta a esses genes não é totalmente compreendido. A capacidade de identificar com precisão os tipos de células e localizar a expressão de factores específicos dentro deles é imperativo para entender melhor o desenvolvimento da próstata. A hibridização in situ (ISH) permite a localização de mRNAs dentro de um tecido. Assim, este método pode ser usado para identificar padrões e tempo de expressão de moléculas sinalizadoras e seus receptores, elucidando assim reguladores de próstata potencial de desenvolvimento. Aqui, descrevemos uma técnica de ISH alta taxa de transferência para identificar padrões de expressão de mRNA na LUT rato fetal usando vibrando micrótomo de corte seções. Este método oferece diversas vantagens sobre outros protocolos de ISH. Realizar ISH em seções finas adere a um slide é tecnicamente difícil; criosecções freqüentemente têm qualidade estrutural pobres, enquanto ambos os criosecções e seções de parafina muitas vezes resultam em resolução do sinal fraco. Realizar ISH em tecidos todo suporte pode resultar em aprisionamento sonda. Em contraste, a nossa técnica de alto rendimento utiliza espessura de corte seções que revelam a arquitetura do tecido detalhadas. Tubos de microcentrífuga modificada permitir fácil manuseio das seções durante o procedimento ISH. Um máximo de 4 transcrições de mRNA podem ser rastreados a partir de um único LUT 17.5dpc com até 24 transcrições de mRNA detectados em uma única corrida, reduzindo custos e maximizando a eficiência. Este método permite que múltiplos grupos de tratamento para ser processado de forma idêntica e como uma única unidade, eliminando assim qualquer viés de interpretação dos dados. Mais pertinente para os pesquisadores de próstata, este método fornece uma localização espacial e temporal de transcritos mRNA baixa e alta abundância na uretra fetal do rato que dá origem à rede ductal da próstata.

Aqui, descrevemos uma produção eficiente de alta<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação método (ISH) para a visualização de padrões de expressão de mRNA no desenvolvimento fetal do rato secções de tecido da próstata. O método pode ser facilmente adaptado para visualizar padrões de expressão de mRNA nos tecidos dos camundongos outros ou em tecidos de outras espécies.

A High Throughput In situ Método de hibridização para caracterizar padrões de expressão de mRNA no Rato Fetal Trato urogenital inferior

O desenvolvimento do trato urogenital inferior (TUI) é um processo intrincado. Essa complexidade é evidenciada durante a formação da próstata a partir do male fetal...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar os padrões de expressão de mRNA em tecidos em desenvolvimento do trato urogenital inferior de camundongos fetais. Isso é realizado primeiramente sintetizando uma sonda ribonucleotídica marcada com digoxigenina a partir de um molde gerado por PCR. O segundo passo do procedimento consiste em gerar cortes espessos utilizando um microtomo vibratório.O terceiro passo é realizar uma hibridização in situ em seções do trato urogenital inferior contidas em cestos personalizados. Os RNAm são visualizados por meio da detecção imuno-histoquímica de sondas de riboprobes ligadas, utilizando o substrato de fosfatase alcalina BM purple que forma precipitado. Em última análise, a microscopia pode mostrar a localização espacial e temporal de transcritos de RNAm de baixa e alta abundância no trato urogenital inferior fetal de camundongo.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a imuno-histoquímica, é que as sondas de RNA são fáceis de gerar e podem ser produzidas para reconhecer a maioria dos RNAs mensageiros em todo o genoma do camundongo. Embora este método forneça informações sobre os padrões de expressão de RNA mensa

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo de hibridização in situ em preparação inteira discute etapas críticas que garantem resultados de alta qualidade e reprodutíveis para estudos de expressão gênica em embriões de camundongo com idade entre E8,5 e E11,5 dias.

Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

Um método de transferência de genes no cérebro do rato em desenvolvimento é descrito usando um único método cirúrgico ea forma especial de eletrodos. Esta técnica exclusiva permite a transfecção de DNA plasmídeo temporal e espacialmente, o que ajudará muitos neurocientistas em estudar o desenvolvimento do cérebro.

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

Morte fetal e perinatal é uma característica comum quando se estuda alterações genéticas que afetam o desenvolvimento cardíaco. De alta freqüência ultra-sonografia tem melhorado 2-D resolução e pode fornecer excelentes informações sobre o desenvolvimento cardíaco precoce e é um método ideal para detectar o impacto sobre a estrutura e função cardíaca antes da morte.

Ecocardiografia Fetal murino

Ultra-alta freqüência ultra-som é uma ferramenta de imagem ao vivo poderoso para examinar anormalidades cardíacas em pequenos animais. Sua noninvasiveness permite manter o estado fisiológico de embriões. Aqui, vamos mostrar o uso do M-modo ultra-som para medir os batimentos cardíacos de embriões em E18.5 no útero.

Na medição utero da frequência cardíaca em rato por não invasiva em modo M Ecocardiografia

Os ratos são amplamente utilizados para estudar Biologia gestacional. No entanto, a terminação de gravidez é necessária para tais estudos, que se opõe a investigações longitudinais e exige o uso de um grande número de animais. Portanto, descrevemos uma técnica não-invasiva da ultra-sonografia de alta frequência para a deteção adiantada e monitoramento de eventos após a implantação no mouse grávido.

Um novo uso da ultra-sonografia tridimensional de alta frequência para caracterização de gravidez precoce no Mouse

micro-RNAs (miRNAs) são sequências de RNA curtas e altamente homólogas, servindo como reguladores pós-transcricional de RNAs mensageiro (mRNAs). Métodos de deteção de miRNA atuais variam em sensibilidade e especificidade. Descreveremos um protocolo que combina a hibridação in situ e imunocoloração para a deteção simultânea de moléculas miRNA e proteína em cortes de tecido de coração de rato.

Tecido-específica miRNA Expression Profiling Mouse coração seções usando em hibridação in Situ

Para reproducibly contar os números dos mRNAs em oócitos individuais, fluorescência única molécula de RNA in situ hibridação (RNA-FISH) foi otimizada para células não-aderentes. Oócitos foram coletados, hibridizados com sondas específicas transcrição e quantificados usando um software de quantificação de imagem.

Uso de uma única molécula fluorescente hibridação In Situ (FISH-SM) para Quantify e Localize os mRNAs em oócitos murino

Aqui apresentamos um método multiplexado de sequenciamento de mRNA de célula única para perfilar a expressão gênica em tecidos embrionários de camundongos. O método de sequenciamento de mRNA de célula única baseada em gotículas (scRNA-Seq) em combinação com estratégias multiplexing pode perfilar células únicas a partir de várias amostras simultaneamente, o que reduz significativamente os custos de reagente e minimiza os efeitos experimentais do lote.

Análise multiplexada do sequenciamento de mRNA celular único de células embrionárias de camundongos

Descrevemos uma técnica para traçar perfis de microRNAs em embriões de camundongos primitivos. Este protocolo supera o desafio da baixa entrada celular e do pequeno enriquecimento do RNA. Este ensaio pode ser usado para analisar alterações na expressão miRNA ao longo do tempo em diferentes linhagens celulares do embrião do camundongo primitivo.

Preparação de Pequenas Bibliotecas de RNA para Sequenciamento de Embriões de Camundongos Primitivos

Este vídeo demonstra de 2 cores montar toda hibridização in situ, um método pelo qual o padrão de expressão espacial e temporal de 2 genes diferentes podem ser visualizados em embriões de galinha jovens. Este método foi originalmente introduzido por David Wilkinson, Henrique Domingos, Phil e David Ingham Ish-Horowicz.

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

Aprenda hibridização in situ em alta vazão para visualizar padrões de expressão de mRNA no trato urogenital inferior fetal de camundongo. Este método eficiente permite estudar a localização espacial e temporal de transcritos em biologia do desenvolvimento.

A High Throughput In situ Método de hibridização para caracterizar padrões de expressão de mRNA no Rato Fetal Trato urogenital inferior (Vídeo) | JoVE Journal

A High Throughput In situ Método de hibridização para caracterizar padrões de expressão de mRNA no Rato Fetal Trato urogenital inferior

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