Um In Vitro Sistema para Estudo de dormência Tumor ea Mude para o crescimento metastático

O objetivo geral do experimento a seguir é observar em tempo real e de maneira de alto rendimento o efeito de agentes potenciais sobre a latência de células tumorais e/ou a saída dessa latência, utilizando o seguinte ensaio in vitro para modelar a latência tumoral ou a transição para crescimento metastático. Isso é alcançado primeiramente cultivando células tumorais latentes e/ou metastáticas em um sistema tridimensional de extrato da membrana basal, ou sistema BME, adaptado a uma plataforma de placa de 96 poços. Quando cultivadas no sistema 3D, as células metastáticas entram em uma fase transitória, latente ou quiescente.

Em contraste, células tumorais que estão dormentes in vivo entram em um estado prolongado de quiescência. No sistema de cultura 3D, as células metastáticas podem então ser tratadas com agentes candidatos para impedir sua transição da quiescência para a proliferação. Enquanto isso, células tumorais dormentes podem ser tratadas com agentes candidatos que possam induzir sua transição da quiescência para a proliferação.

O comportamento proliferativo das células dormentes e metastáticas em consequência do tratamento será avaliado pela adição do kit de ensaio de proliferação celular Cell Titer 96 Aqueous One Solution nos pontos temporais desejados para análise em um leitor de placas ELIZA. Os resultados obtidos mostram o efeito do tratamento na proliferação celular de células tumorais dormentes ou metastáticas, com base em um ensaio de proliferação celular no sistema 3D. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de metástase, como quais fatores e mecanismos celulares mantêm as células tumorais disseminadas em estado de dormência e quais fatores e mecanismos celulares induzem a transição da dormência tumoral para metástase clínica Thaw.

O fator de crescimento Qualtrics reduziu o BME em um refrigerador a quatro graus Celsius durante a noite anterior ao dia em que o ensaio de proliferação deve ser realizado. Em seguida, no dia do ensaio, selecione uma cultura de células tumorais dormentes ou metastáticas para o experimento. A seguir, coloque uma placa de 96 poços sobre uma bandeja de gelo dentro de uma cabine de segurança ou capela.

Em seguida, utilize um dispensador com uma seringa para revestir cada poço da placa com 50 microlitros do BME gelado descongelado. Certifique-se de que não se formem bolhas nos poços; coloque a placa de 96 poços revestida com BME em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, coloque um frasco de tripsina a 37 graus Celsius para aquecer enquanto a placa revestida com BME estiver em incubação.

Aspire o meio das células tumorais. Enxágue as placas de cultura com 10 mililitros de PBS. Em seguida, aspire o PBS e adicione dois mililitros da tripsina pré-aquecida às placas de cultura.

Incube as placas por cinco minutos. Adicione cinco mililitros de DMEM com alta concentração de glicose, suplementado com 10% de FCS e antibióticos, a um tubo cônico de 15 mililitros. Durante este período.

Após a incubação, transfira as células destacadas para o tubo de 15 mililitros e conte as células. Em seguida, centrifugue o número total de células a serem cultivadas em uma centrífuga de cultura de tecidos por cinco minutos a 1500 G em temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante.

Deixe um pouco do meio, pois na maioria dos casos o pellet não é visível. Em seguida, agite suavemente a base do tubo para garantir a obtenção de uma suspensão simples de células. A seguir, re-suspenda o pellet com 100 microlitros de meio de ensaio para cada duas vezes 10 à terceira células.

Triture as células várias vezes com uma pipeta de cinco mililitros para garantir que seja mantida uma suspensão de células simples. Plaque 100 microlitros de suspensão celular por poço em uma placa revestida com BME de 96 poços para a placa de controle de desvalorização de fundo; adicione adicionalmente 100 microlitros por poço de meio de ensaio apenas a alguns poços da placa revestida com BME de 96 poços. Em seguida, incube as placas, aspire o meio antigo e alimente as células com meio de ensaio novo a cada quatro dias.

Para avaliar a proliferação celular, adicione 20 microlitros da solução aquosa Cell Titer 96 um de um kit de ensaio de proliferação celular por poço a cada placa de 96 poços a ser analisada no ponto temporal experimental desejado. Incube as placas por duas horas. Em seguida, utilizando um leitor de placas ELISA, registre a absorbância dos poços experimentais e de fundo em 490 nanômetros em preparação para imunofluorescência.

Coloração de moléculas de sinalização celular e células tumorais: descongele uma BME em uma geladeira a quatro graus Celsius durante a noite anterior ao dia em que a coloração será realizada. No dia da coloração, coloque um sistema de lâmina de vidro com oito câmaras sobre uma bandeja de gelo dentro de uma cabine de segurança biológica ou capela. Em seguida, utilize uma pipeta de 200 microlitros para revestir cada poço do sistema de lâmina de vidro com 50 microlitros de BME gelada.

Certifique-se de que o BME seja distribuído uniformemente e de que nenhuma bolha se forme nos poços. Incube as lâminas revestidas por 20 minutos. Selecione uma linha celular de tumor dormente ou metastático.

Colete as células usando tripsina conforme descrito anteriormente. Em seguida, reúna o número total de células a serem cultivadas em um tubo cônico de 15 mililitros. Agora, centrifugue as células, aspire cuidadosamente o sobrenadante novamente, deixando um pouco de meio residual.

Para o pellet, bata suavemente na base do tubo cônico de 15 mililitros para obter uma suspensão de células únicas. Re-suspenda o pellet com 400 microlitros de meio de ensaio para cada cinco vezes 10 à terceira células. Pipete as células várias vezes com uma pipeta de cinco mililitros para garantir que a suspensão de células únicas seja mantida. Plaque 400 microlitros da solução celular por poço em cada uma das oito câmaras revestidas com BME.

Em seguida, incubar o sistema de lâmina de vidro, aspirar o meio antigo e repor as células com meio de ensaio novo a cada quatro dias nos pontos temporais experimentais desejados. Aspirar a camada superior do meio e adicionar 200 microlitros de fixador suplementado com triton, incubando à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, aspirar o fixador suplementado com triton e adicionar apenas 200 microlitros de fixador, incubando à temperatura ambiente por mais 25 minutos.

Aspire novamente o fixador e agora adicione 400 microlitros de PBS a cada poço. Incube a placa por mais 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, aspire o PBS e adicione 400 microlitros de PBS contendo 0,05% entre 20 e incube por mais 10 minutos.

Também à temperatura ambiente. Agora, bloquee as células fixadas com 200 microlitros de solução bloqueadora. Em seguida, incube as células à temperatura ambiente por uma hora; após a incubação, aspire a solução bloqueadora e adicione 200 microlitros do anticorpo primário diluído na solução bloqueadora a cada amostra.

Incube bem os lâminas com o anticorpo primário durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte. Aspire o anticorpo, depois lave os poços três vezes adicionando 400 microlitros de PBS por 15 minutos e, em seguida, aspire a solução após cada lavagem. Após aspirar o PBS da última lavagem, adicione 200 microlitros de um anticorpo secundário conjugado à rodamina vermelha.

Em seguida, cubra o sistema de lâmina de oito câmaras com papel alumínio e incube por uma hora em temperatura ambiente. A seguir, lave as cavidades três vezes com PBS como antes, após a terceira lavagem monte as lâminas em meio de montagem beta shield com dpi.

Por fim, seque as lâminas por 40 minutos à temperatura ambiente no escuro. Um exemplo de análise de proliferação das células tumorais dormentes D 2.0 R e metastáticas D two A one em cultura tridimensional é mostrado aqui. As células D 2.0 R permanecem dormentes durante todo o período experimental de 14 dias de cultura, enquanto as células altamente metastáticas D two A one permanecem dormentes apenas por quatro a seis dias de cultura, após os quais começam a proliferar durante a fase inicial de latência.

Muitas células permanecem solitárias no cultivo 3D, como mostrado aqui em uma foto representativa de um cultivo do dia quatro, enquanto outras células não proliferativas formam esteroides multicelulares. A transição de células D two A one de um estado dormente para um estado proliferativo no cultivo 3D é mostrada aqui nesta foto de um cultivo do dia 12. Está associada a mudanças dramáticas na morfologia celular nesta figura.

Um exemplo de um agente que impede que células D two A one transitem de um estado dormente para um estado proliferativo é mostrado em tratamentos das células D two A one com um inibidor específico contra a quinase da cadeia leve da miosina. Mantenha as células D two A one em um estado dormente conforme ilustrado nesta figura. Um aumento significativo na fosforilação da cadeia leve da miosina nas células D two A one em vermelho, seguido pela reorganização dos filamentos de F-actina formando fibras de estresse de actina em verde, ocorre durante sua transição da dormência dos dias um a quatro para a proliferação.

Dia sete. No entanto, o bloqueio da atividade da quinase da cadeia leve da miosina em células D2A1 por SHRA ou pelo fármaco ML7 mantém as células D2A1 em um estado dormente e resulta na inibição da fosforilação da cadeia leve da miosina, da F act e da organização das fibras de estresse, conforme visto aqui. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar o sistema modelo in vitro para estudar a dormência tumoral e a transição para crescimento metastático.