A Pele Tridimensional Humanos Reconstruir Modelo: uma Ferramenta para o Estudo da Pele Normal e Progressão Melanoma

O objetivo geral deste procedimento é gerar uma reconstrução 3D da pele humana para estudos de melanócitos, melanoma e biologia de células-tronco da pele. Isso é feito primeiro revestindo uma inserção de bandejas de cultura de tecidos com colágeno bovino neutralizado. O segundo passo é fazer o compartimento dérmico celular a partir de fibroblastos e colágeno.

Em seguida, faça o compartimento epidérmico de queratinócitos misturados com melanócitos ou células de melanoma. A etapa final do procedimento é colher uma reconstrução de pele no dia 18 e enxertar uma reconstrução de pele em um camundongo. Em última análise, as análises imuno-histoquímicas e imunofluorescentes do enxerto mostram a arquitetura da pele normal contendo melanócitos, a migração e a diferenciação de células-tronco normais e fenótipos de melanoma específicos do estágio.

Desenvolvemos o modelo de reconstrução da pele há 20 anos porque, no início de nossos estudos, descobrimos que melanócitos normais ou células de melanoma cultivadas em um prato se comportam de maneira muito diferente das células que estão em um contexto de tecido. Portanto, o modelo de reconstrução da pele é ideal para vermos como as células se movem de um compartimento da pele para qualquer outro lugar. A mistura de colágeno da camada acelular previamente preparada no gelo e, em seguida, adicione um mililitro da solução amarelo palha em cada inserção de seis.

Bandeja de cultura de tecidos bem, incube a bandeja por 30 minutos em temperatura ambiente para permitir que o gel solidifique. Durante esse período, a solução deve mudar de cor de amarelo para rosa enquanto o gel solidifica os olhos de tripsina, o jato de fibra humana de seu frasco de cultura com 0,25% de tripsina EDTA após cinco minutos. Adicione DMEM contendo 10% FBS para neutralizar o processo de ização.

Coletar as células destacadas por centrifugação por cinco minutos a 200 G à temperatura ambiente e, em seguida, ressuspender as células a 4,5 vezes 10 elevado à quinta célula por 1,5 mililitros. DMEM suplementado com 10% de FBS. Em seguida, encha um tubo de 50 mililitros com a mistura de colágeno da camada celular previamente preparada e coloque o tubo no gelo.

Adicione 1,5 mililitros da suspensão de fibroblastos ao tubo e misture. Adicione três mililitros da solução de camada celular amarelo palha a cada inserto revestido com camada acelular. Em seguida, incube a bandeja de cultura de tecidos por 45 minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecidos de 5% de dióxido de carbono durante o período de incubação.

A cor da solução da camada celular também deve mudar de amarelo para rosa. Depois que o gel da camada superior solidificar, adicione dois mililitros de DMEM contendo 10% de FBS no interior da inserção na bandeja de cultura de tecidos e 10 mililitros na parte externa da inserção. Incubar as bandejas de cultura de tecidos por quatro dias.

Verificando no quarto dia se o gel se contrai no quarto dia de incubação, aspire o meio por dentro e por fora de cada inserção. Adicione dois mililitros de meio de lavagem no interior e 10 mililitros no exterior das inserções para lavar o soro normal. Em seguida, incube as bandejas por uma hora a 37 graus Celsius para geração da epiderme.

A primeira tripsina são os queratinócitos humanos. Então, após cinco minutos, use o inibidor de tripsina de soja para neutralizar a tripsina depois de girar as células destacadas a 200 G por cinco minutos. Reus suspende o pellet celular em 4,17 vezes 10 elevado a seis células por mililitro na pele.

Reconstruir o meio um após a colheita dos queratinócitos. A tripsina congela os melanócitos humanos por um a dois minutos. Novamente, neutralize a tripsina com inibidor de tripsina de soja.

Em seguida, depois de girar as células nas mesmas condições de antes, ressuspenda o grânulo de melanócitos a 8,3 vezes 10 elevado à quinta célula por mililitro na pele. Reconstrua o médio também. Em seguida, remova o meio de lavagem de dentro e de fora de cada inserção de uma bandeja de cultura de tecidos preparada para camada dérmica.

Substitua o meio de lavagem adicionando 1,5 mililitros de pele, reconstrua o meio, um para dentro e 10 mililitros para fora de cada inserção. Em seguida, misture 600 microlitros da suspensão de células de queratinócitos com 600 microlitros da suspensão de melanócitos. Dispense 200 microlitros da suspensão de células mistas.

Gota a gota para o interior de cada inserção. Incube a bandeja de cultura de tecidos por dois dias a 37 graus Celsius. Depois de incubar as células, aspire a pele, reconstrua o meio um por dentro e por fora de cada inserto e, em seguida, adicione dois mililitros de pele, reconstrua o meio, dois por dentro e 10 mililitros por fora do inserto.

Em seguida, incube as reconstruções por mais dois dias a 37 graus Celsius. Após o segundo dois dias de incubação, aspirar a pele, reconstruir o meio dois por dentro e por fora de cada inserção. Agora adicione 7,5 mililitros de pele, reconstrua o meio três apenas na parte externa das inserções.

Coloque os reconstruídos de volta na incubadora e troque a pele. Reconstrua o meio três a cada dois dias até o dia 18. No dia 18 da incubação, aspire o meio de dentro e de fora das inserções de uma bandeja de cultura de tecidos carregada para reconstrução da pele.

Remova as inserções da bandeja com uma pinça. Corte a construção, incluindo o filtro de policarbonato, traçando um círculo próximo à borda com uma lâmina de bisturi. Em seguida, coloque o reconstruído no filtro em uma superfície dura e corte-os ao meio com a lâmina.

Coloque metade da reconstrução em um papel de biópsia TBS preto e, em seguida, coloque o papel em um de histologia. Mergulhe todo o em 10% de formalina por mais de quatro horas. Em seguida, coloque o em etanol a 70% e armazene-o a quatro graus Celsius até que esteja pronto para processar a reconstrução para incorporação de parafina.

Coloque a outra metade da reconstrução em sacarose a 50% a quatro graus Celsius por uma a duas horas. Em seguida, mude a sacarose para dois molares e armazene-a a quatro graus Celsius por mais uma a duas horas. Encha um molde de base até a metade com temperatura de corte ideal, meio de congelamento ou OCT.

Evite bolhas. Segure a borda da reconstrução com uma pinça e remova a reconstrução da sacarose. Coloque-o em lenços umedecidos Kim até que a sacarose seja absorvida.

Usando uma pinça e uma espátula, transfira a reconstrução para o barco em cima da OCT. Cubra a parte superior da reconstrução com mais OCT até que o barco esteja completamente cheio. Mais uma vez, evitando bolhas.

Coloque o barco uniformemente em gelo seco picado para permitir que o OCT congele completamente. Em seguida, embrulhe o molde de base e o papel alumínio e armazene-o a 70 graus Celsius negativos até que esteja pronto para cortá-lo com um criostato. Para se preparar para o enxerto de uma reconstrução de pele em um camundongo, encha um recipiente com nitrogênio líquido e adicione cinco mililitros de DMEM a um tubo de 50 mililitros.

Encha um copo com 600 mililitros de água da torneira e coloque o copo em cima de uma chapa quente para aquecer. Em seguida, selecione uma fêmea de camundongo sem pêlos com cerca de seis semanas de idade. Depois de anestesiar o camundongo com flúor isof.

Use um cone nasal para manter a anestesia durante todo o procedimento. Aplique lubrificante oftálmico estéril e forneça suporte térmico para evitar hipotermia. Em seguida, limpe a pele do camundongo com tintura composta de benjoim e cotonetes de preparação com álcool.

Marque uma linha na parte superior do mouse para manter a mesma posição para sutura posterior. Corte uma cama redonda na parte de trás do rato usando uma tesoura de íris e uma pinça e, em seguida, cubra o leito da ferida com esponjas de gaze estéreis. Coloque a pele redonda do rato no tubo de 50 mililitros de DMEM.

Mergulhe o tubo em um recipiente de nitrogênio líquido até que todos os meios e tecidos estejam totalmente congelados. Em seguida, descongele o tubo em um copo de água quente até descongelar totalmente. Repita isso, congele e descongele o procedimento três vezes.

Use uma lâmina cirúrgica para desprender uma reconstrução de pele de uma inserção. Remova a membrana com muito cuidado e, em seguida, transfira a reconstrução da pele para o topo do leito da ferida do camundongo. Agora, coloque a pele do mouse em cima da reconstrução da pele.

Certifique-se de que a primeira sutura esteja em cima do marcador previamente rotulado e que a segunda esteja na parte inferior. Em seguida, use mais duas suturas nas laterais da pele para reconstruir para fixar a pele do rato. Limpe a pele do camundongo após o enxerto e, em seguida, coloque o camundongo em uma nova gaiola.

No dia 18. A epiderme das reconstruções cutâneas é composta por camadas estratificadas de queratinócitos, a camada basal indiferenciada e as camadas sequencialmente diferenciadas são orientadas verticalmente. Coloração da seção de reconstruções com o marcador melanocítico.

S 100, conforme indicado pelas setas pretas, mostra que os melanócitos estão alinhados na camada basal da epiderme e se comunicam com múltiplos queratinócitos por meio de extensões dendríticas. O compartimento dérmico contém fibroblastos embutidos em uma matriz de colágeno tipo um depositado colágeno quatro indica a membrana basal, que separa a epiderme da derme. As figuras a seguir ilustram como várias camadas de queratinócitos na epiderme são desenvolvidas.

Quando as células-tronco dérmicas marcadas com um vetor lentiviral GFP são incorporadas com fibroblastos. Em uma matriz de colágeno tipo um, eles migram para a epiderme e se diferenciam em melanócitos no quinto dia. Após a semeadura de queratinócitos, células individuais começam a migrar para fora das esferas.

Observe que a epiderme ainda é composta por uma única camada. No oitavo dia. Algumas células atingem a interface da derme da epiderme.

No dia 10, as células GFP positivas estão firmemente alinhadas na posição da membrana basal, como pode ser visto aqui. As células positivas para GFP migradas na epiderme expressam o marcador melanocítico HMB 45. Quando diferentes estágios de linhagens celulares de melanoma são incorporados em reconstruções cutâneas, o comportamento das células reflete suas características in vivo.

Aqui, melanócitos normais e células de melanoma cultivadas em culturas 2D podem ser vistos nesta figura. A localização e a taxa de crescimento dos melanócitos normais são rigidamente controladas nas reconstruções da pele, como visto aqui, na fase de crescimento radial, os melanomas primários proliferam predominantemente na epiderme, enquanto os melanomas na fase de crescimento vertical crescem invasivamente na derme, como visto nesta figura. Finalmente, a maneira como os melanomas metastáticos invadem agressivamente a derme pode ser vista aqui.

Nossos estudos em pele normal fornecem a base para um melhor conhecimento do desenvolvimento e progressão do melanoma.