A Pele Tridimensional Humanos Reconstruir Modelo: uma Ferramenta para o Estudo da Pele Normal e Progressão Melanoma
3 de agosto de 2011
Neste relatório, nós descrevemos a pele tridimensional reconstruir modelo que imita a pele humana em arquitetura e composição. Fisiologia dos melanócitos, a progressão de melanoma eo destino de células-tronco dérmica foram investigados usando a pele reconstruir modelo. O modelo também é útil como uma ferramenta de pré-clínicos para avaliação de drogas.
O objetivo geral deste procedimento é gerar um modelo tridimensional de pele humana reconstruída para estudos da biologia de melanócitos, melanoma e células-tronco da pele. Isso é realizado primeiramente revestindo um inserto de placas de cultura de tecidos com colágeno bovino neutralizado. O segundo passo consiste em produzir o compartimento dérmico celular a partir de fibroblastos e colágeno.
Em seguida, prepare o compartimento epidérmico a partir de queratinócitos misturados com melanócitos ou células de melanoma. O passo final do procedimento é colher um reconstituto cutâneo no dia 18 e enxertar o reconstituto cutâneo em um camundongo. Por fim, análises imuno-histoquímicas e imunofluorescentes do enxerto revelam a arquitetura da pele normal contendo melanócitos, a migração e a diferenciação de células-tronco normais e fenótipos específicos de estágio do melanoma.
Desenvolvemos o modelo de reconstrução da pele há 20 anos porque, logo no início de nossos estudos, descobrimos que melanócitos normais ou células de melanoma cultivadas em uma placa se comportam de maneira muito diferente em comparação com células que estão em um contexto tecidual. Assim, o modelo de reconstrução da pele é ideal para observarmos como as células se movem de um compartimento na pele para qualquer outro local. A mistura de colágeno da camada acelular previamente preparada é mantida em gelo e, em seguida, adiciona-se um mililitro da solução amarelo-palha a cada inserto de uma placa de seis.
Incube a bandeja de cultura de tecidos em estufa por 30 minutos à temperatura ambiente para permitir que o gel se solidifique. Durante esse período, a solução deve mudar de cor de amarelo para rosa enquanto o gel se solidifica. Desprenda os fibroblastos humanos do frasco de cultura com tripsina-EDTA 0,25% após cinco minutos. Adicione DMEM contendo 10% de SBF para neutralizar o processo de dessocialização.
Coletar as células destacadas por centrifugação durante cinco minutos a 200 ×g em temperatura ambiente e, em seguida, ressuspender as células em 4,5 vezes 10 à quinta células por 1,5 mililitro de DMEM suplementado com 10% de FBS. Em seguida, encher um tubo de 50 mililitros com a mistura de colágeno da camada celular previamente preparada e colocar o tubo no gelo.
Adicione 1,5 mililitros da suspensão de fibroblastos ao tubo e misture bem. Adicione três mililitros da solução amarelo-palha da camada celular a cada inserto revestido com camada acelular. Em seguida, incube a placa de cultura de tecidos por 45 minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecidos com 5% de dióxido de carbono durante o período de incubação.
A cor da solução da camada celular também deve mudar de amarela para rosa. Após a camada superior do gel solidificar, adicione dois mililitros de DMEM contendo 10% de FBS ao interior do inserto na bandeja de cultura de tecidos e 10 mililitros ao exterior do inserto. Incube as bandejas de cultura de tecidos por quatro dias.
No quarto dia, verifique se o gel contraiu; no quarto dia de incubação, aspire o meio de dentro e de fora de cada inserto. Adicione dois mililitros de meio de lavagem no interior e 10 mililitros no exterior dos insertos para remover o soro comum. Em seguida, incube as placas por uma hora a 37 graus Celsius para a geração da epiderme.
Primeiro, a tripsina é aplicada em queratinócitos humanos. Em seguida, após cinco minutos, utilize inibidor de tripsina de soja para neutralizar a tripsina, após centrifugar as células destacadas a 200 ×g por cinco minutos. Resuspenda o pellet celular a 4,17 × 10⁶ células por mililitro na pele.
Reconstrua o meio logo após a colheita dos queratinócitos. Incube os melanócitos humanos com tripsina no gelo por um a dois minutos. Novamente, neutralize a tripsina com inibidor de tripsina de soja.
Em seguida, após centrifugar as células nas mesmas condições que anteriormente, ressuspender o pellet de melanócitos a 8,3 vezes 10 à quinta células por mililitro em meio de reconstrução cutânea. Preparar também o meio de reconstrução um. A seguir, remover o meio de lavagem tanto do interior quanto do exterior de cada inserto de uma bandeja de cultura tecidual com camada dérmica preparada.
Substitua o meio de lavagem adicionando 1,5 mililitros do meio de reconstituição da pele, um para o interior e 10 mililitros para o exterior de cada inserto. Em seguida, misture 600 microlitros da suspensão de células queratinócitos com 600 microlitros da suspensão de melanócitos. Distribua 200 microlitros da suspensão celular mista.
Gota a gota, adicione ao interior de cada inserto. Incube a placa de cultura de tecidos por dois dias a 37 graus Celsius. Após a incubação das células, aspire o meio de reconstrução da pele, meio um, tanto do interior quanto do exterior de cada inserto e, em seguida, adicione dois mililitros do meio de reconstrução da pele, meio dois, ao interior e 10 mililitros ao exterior do inserto.
Em seguida, incubar os reconstrutos por mais dois dias a 37 graus Celsius. Após a segunda incubação de dois dias, aspirar o meio de reconstrução da pele dois do interior e do exterior de cada inserto. Agora, adicionar 7,5 mililitros do meio de reconstrução da pele três somente ao exterior dos insertos.
Coloque os reconstrutos de volta no incubador e troque o meio de cultura a cada dois dias até o dia 18. No dia 18 da incubação, aspire o meio do interior e do exterior dos insertos de uma bandeja de cultura tecidual com reconstruto de pele.
Remova os insertos da bandeja com pinças. Recorte o construto incluindo o filtro de policarbonato, traçando um círculo próximo à borda com uma lâmina de bisturi. Em seguida, coloque o reconstruto no filtro sobre uma superfície dura e corte-o ao meio com a lâmina.
Coloque uma metade do reconstruto em um papel de biópsia TBS preto e, em seguida, coloque o papel em um cassete de histologia. Mergulhe todo o cassete em formalina a 10% por mais de quatro horas. Em seguida, coloque o cassete em etanol a 70% e armazene-o a quatro graus Celsius até que você esteja pronto para processar o reconstruto para inclusão em parafina.
Coloque a outra metade do reconstruto em sacarose a 50% a quatro graus Celsius por uma a duas horas. Em seguida, substitua a sacarose por solução dois molar e armazene-a a quatro graus Celsius por mais uma a duas horas. Encha um molde base até a metade com temperatura de corte ideal, meio de congelamento ou OCT.
Evite qualquer bolha. Segure a borda do reconstituído com pinças e remova-o da sacarose. Coloque-o em lenços Kim até que a sacarose seja absorvida.
Usando pinças e uma espátula, transfira o reconstituído para o barquinho sobre o OCT. Cubra a parte superior do reconstituído com mais OCT até que o barquinho esteja completamente cheio. Novamente, evitando bolhas.
Coloque o barquinho uniformemente sobre gelo seco triturado para permitir que o OCT congele completamente. Em seguida, envolva o molde da base com papel alumínio e armazene-o a menos 70 graus Celsius até que esteja pronto para cortá-lo com um criostato. Para se preparar para enxertar uma reconstrução da pele em um camundongo, encha um recipiente com nitrogênio líquido e adicione cinco mililitros de DMEM a um tubo de 50 mililitros.
Encha um béquer com 600 mililitros de água da torneira e coloque o béquer sobre uma placa aquecedora para aquecer. Em seguida, selecione um camundongo fêmea pelado, outbred, com cerca de seis semanas de idade. Após anestesiar o camundongo com isoflurano.
Utilize um cone nasal para manter a anestesia durante todo o procedimento. Aplique lubrificante oftálmico estéril e forneça suporte térmico para prevenir hipotermia. Em seguida, limpe a pele do camundongo com tintura de benjoim composta e lenços pré-umedecidos com álcool.
Marque uma linha na parte superior das costas do camundongo para manter a mesma posição para a sutura posterior. Corte um leito de ferida circular nas costas do camundongo usando tesoura de íris e pinça, e então cubra o leito da ferida com esponjas de gaze estéril. Coloque a pele circular do camundongo no tubo de 50 mililitros contendo DMEM.
Mergulhe o tubo em um recipiente com nitrogênio líquido até que todo o meio e o tecido estejam completamente congelados. Em seguida, descongele o tubo em um béquer com água quente até que esteja totalmente derretido. Repita este procedimento de congelamento e descongelamento três vezes.
Use uma lâmina cirúrgica para destacar um reconstituído da pele de um inserto. Remova a membrana com muita cautela e, em seguida, transfira o reconstituído da pele para o topo do leito da ferida do camundongo. Agora, posicione a pele do camundongo sobre o reconstituído da pele.
Certifique-se de que o primeiro ponto esteja sobre o marcador previamente identificado e que o segundo esteja na parte inferior. Em seguida, utilize mais dois pontos nas laterais da reconstrução da pele para fixar a pele do camundongo. Limpe a pele do camundongo após o enxerto e, então, coloque o camundongo em uma nova gaiola.
No dia 18, a epiderme de reconstruções cutâneas é composta por camadas estratificadas de queratinócitos, sendo a camada basal indiferenciada e as camadas diferenciadas sequencialmente orientadas verticalmente. Coloração da seção de reconstruções com o marcador melanocítico.
S 100, conforme indicado pelas setas pretas, mostra que os melanócitos estão alinhados na camada basal da epiderme e se comunicam com múltiplos queratinócitos por meio de extensões dendríticas. O compartimento dérmico contém fibroblastos embutidos em uma matriz de colágeno tipo um; o colágeno tipo quatro indica a membrana basal, que separa a epiderme da derme. As figuras a seguir ilustram como múltiplas camadas de queratinócitos na epiderme são desenvolvidas.
Quando células-tronco dérmicas marcadas com um vetor lentiviral GFP são incorporadas com fibroblastos em uma matriz de colágeno tipo um, elas migram para a epiderme e se diferenciam em melanócitos no quinto dia. Após o cultivo de queratinócitos, células individuais começam a migrar para fora das esferas.
Observe que a epiderme ainda é composta por uma única camada. No oitavo dia, algumas células alcançam a interface entre a epiderme e a derme.
No dia 10, as células positivas para GFP estão firmemente alinhadas na posição da membrana basal, como pode ser observado aqui. As células positivas para GFP que migraram para a epiderme expressam o marcador melanocítico HMB 45. Quando diferentes estágios de linhagens celulares de melanoma são incorporados em reconstruções cutâneas, o comportamento das células reflete suas características in vivo.
Aqui, melanócitos normais e células de melanoma cultivadas em culturas 2D podem ser observados nesta figura. A localização e a taxa de crescimento dos melanócitos normais são estritamente controladas nos reconstrutos cutâneos, conforme visto aqui; melanomas primários em fase de crescimento radial proliferam predominantemente na epiderme, enquanto melanomas em fase de crescimento vertical crescem de forma invasiva na derme, como observado nesta figura. Por fim, a maneira como os melanomas metastáticos invadem agressivamente nas camadas profundas da derme pode ser vista aqui.
Nossos estudos em pele normal fornecem a base para um melhor entendimento do desenvolvimento e progressão do melanoma.
Visão Geral
Este relato descreve um modelo de reconstrução tridimensional da pele que imita a arquitetura e a composição da pele humana. O modelo tem sido utilizado para estudar a fisiologia dos melanócitos, a progressão do melanoma e o destino das células-tronco dérmicas, servindo como uma ferramenta pré-clínica valiosa para avaliação de fármacos.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Oncologia
Contexto
- O modelo de reconstrução da pele foi desenvolvido para compreender melhor o comportamento celular em um contexto tecidual.
- Melanócitos normais e células de melanoma exibem comportamentos diferentes em cultura comparados ao in vivo.
- Este modelo permite a observação da migração e diferenciação celular dentro dos compartimentos da pele.
- Ele está em desenvolvimento há mais de 20 anos, fornecendo insights sobre a biologia da pele.
Objetivo do Estudo
- Gerar um modelo tridimensional de pele humana reconstruída para o estudo da biologia de melanócitos e melanoma.
- Investigar as interações entre diferentes tipos celulares da pele.
- Avaliar a utilidade do modelo em testes pré-clínicos de fármacos.
Métodos Utilizados
- Revestimento de bandejas de cultura de tecidos com colágeno bovino neutralizado.
- Criação de um compartimento dérmico celular utilizando fibroblastos e colágeno.
- Formação de um compartimento epidérmico a partir de queratinócitos misturados com melanócitos ou células de melanoma.
- Realização de análises imuno-histoquímicas e imunofluorescentes em reconstrutos de pele enxertados.
Resultados Principais
- O reconstituto da pele mimou com sucesso a arquitetura da pele humana normal.
- Melanócitos e células-tronco demonstraram migração e diferenciação dentro do modelo.
- Fenótipos de melanoma específicos a cada estágio foram observados na pele reconstituída.
- O modelo mostrou-se eficaz para avaliação pré-clínica de fármacos.
Conclusões
- O modelo de reconstrução cutânea tridimensional é uma ferramenta valiosa para o estudo da biologia da pele.
- Ele fornece informações sobre o comportamento dos melanócitos e a progressão do melanoma.
- O modelo pode facilitar o desenvolvimento e a testagem de novas estratégias terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O modelo tridimensional de pele humana reconstruída permite investigações preditivas e relevantes para o ser humano da biologia dos melanócitos e da progressão do melanoma, superando as limitações traducionais dos cultivos em 2D e dos sistemas murinos. Este modelo oferece suporte à desmistificação mecanicista e à validação de alvos para pipelines iniciais de oncologia e dermatologia. Sua capacidade de recapitular interações nativas célula-célula e célula-matriz fornece uma plataforma robusta para triagem de portfólios e tomada de decisões pré-clínicas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da homeostase de melanócitos e da iniciação de melanoma em um contexto fisiologicamente relevante.
- Permite a validação funcional de alvos por meio da modelagem da migração celular, diferenciação e progressão tumoral.
- Facilita a desmistificação mecanicista ao distinguir fenótipos de melanoma específicos a cada estágio em uma arquitetura tecidual semelhante à humana.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Oferece um sistema 3D validado para avaliação quantitativa do comportamento celular e dos efeitos de compostos.
- Permite a medição reprodutível da localização celular, proliferação e invasão em diferentes condições experimentais.
- Apóia a padronização de ensaios para triagem subsequente de terapêuticas candidatas que visam a biologia da pele ou do melanoma.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se à arquitetura da pele humana relevante para doenças, melhorando a confiança translacional em comparação com modelos murinos.
- Permite a avaliação da migração e diferenciação de células-tronco, apoiando a descoberta e validação de biomarcadores.
- Permite o avanço de candidatos com risco ajustado ao modelar o potencial metastático e as interações com o microambiente tumoral.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este modelo de reconstrução cutânea tridimensional integra a descoberta inicial, a validação de alvos e a pesquisa pré-clínica para programas de pele e melanoma.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre interações célula-célula e célula-matriz no contexto da pele humana.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis para avaliação de compostos e triagem fenotípica.
- Análises: Permite leituras imuno-histoquímicas e imunofluorescentes para análise comparativa de estados celulares e progressão tumoral.
- Pesquisa Translacional: Oferece continuidade do descobrimento in vitro à validação semelhante à in vivo, aumentando o valor preditivo para a translação clínica.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma reutilizável adaptável a diversos tipos celulares e modelos de doenças nos portfólios de dermatologia e oncologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa de pele e melanoma.
- Valor Operacional: Padroniza a modelagem de tecidos complexos, melhorando a reprodutibilidade e a escalabilidade entre equipes de P&D.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avançar/não avançar e a alocação de capital ao fornecer dados relevantes para humanos no início do processo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de candidatos terapêuticos direcionados à biologia da pele e do melanoma.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em cultura de células primárias, engenharia de tecidos e análise histológica.
- Requer acesso a infraestrutura especializada de cultura de tecidos e plataformas de imagem para análises finais.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos para reprodutibilidade e comparabilidade dos dados.
- Adaptável a diversos tipos celulares e modelos de doenças, mas pode ser necessária otimização para questões de pesquisa específicas.
- As limitações incluem a necessidade de habilidade técnica em cultura tridimensional e a variabilidade potencial nas fontes de células primárias.
