Name: Medição bioquímicos da Hipóxia Neonatal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Aprenda a medir marcadores bioquímicos de hipóxia neonatal usando HPLC e GC/MS em amostras de plasma de recém-nascidos. Este método permite quantificar hipoxantina, xantina, ácido úrico, alantoína e MDA para diagnóstico precoce.

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<ol><li>Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrapartum+hypoxia%3A+the+association+between+neurological+assessment+of+damage+and+abnormal+excretion+of+ATP+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites.</a> J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).</li>
<li>Shalak, L., Perlman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxic-ischemic+brain+injury+in+the+term+infant-current+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Hum+Dev%22%5BJournal%5D)">Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant-current concepts.</a> Early Hum Dev. 80, 125-141 (2004).</li>
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<li>Choi, E. Y., Stockert, A. L., Leimkuhler, S., Hille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanism+of+action+of+xanthine+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inorg+Biochem%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanism of action of xanthine oxidase.</a> J Inorg Biochem. 98, 841-848 (2004).</li>
<li>Godber, B. L., Schwarz, G., Mendel, R. R., Lowe, D. J., Bray, R. C., Eisenthal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+human+xanthine+oxidoreductase%3A+the+enzyme+is+grossly+deficient+in+molybdenum+and+substantially+deficient+in+iron-sulphur+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of human xanthine oxidoreductase: the enzyme is grossly deficient in molybdenum and substantially deficient in iron-sulphur centres.</a> Biochem J. 388, 501-508 (2005).</li>
<li>Gruber, J., Tang, S. Y., Jenner, A. M., Mudway, I., Blomberg, A., Behndig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allantoin+in+human+plasma%2C+serum%2C+and+nasal-lining+fluids+as+a+biomarker+of+oxidative+stress%3A+avoiding+artifacts+and+establishing+real+in+vivo+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Allantoin in human plasma, serum, and nasal-lining fluids as a biomarker of oxidative stress: avoiding artifacts and establishing real in vivo concentrations.</a> Antioxid Redox Signal. 11, 1767-1776 (2009).</li>
<li>Zitnanova, I., Korytar, P., Aruoma, O. I., Sustrova, M., Garaiova, I., Muchova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uric+acid+and+allantoin+levels+in+Down+syndrome%3A+antioxidant+and+oxidative+stress+mechanisms%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Uric acid and allantoin levels in Down syndrome: antioxidant and oxidative stress mechanisms?</a> Clin Chim Acta. 341, 139-146 (2004).</li>
<li>Siciarz, A., Weinberger, B., Witz, G., Hiatt, M., Hegyi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+thiobarbituric+acid-reacting+substances+as+potential+biomarkers+of+intrauterine+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pediatr+Adolesc+Med%22%5BJournal%5D)">Urinary thiobarbituric acid-reacting substances as potential biomarkers of intrauterine hypoxia.</a> Arch Pediatr Adolesc Med. 155, 718-722 (2001).</li>
<li>Buonocore, G., Perrone, S., Longini, M., Terzuoli, L., Bracci, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+hydroperoxide+and+advanced+oxidation+protein+products+in+preterm+hypoxic+babies%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Total hydroperoxide and advanced oxidation protein products in preterm hypoxic babies.</a> Pediatr Res. 47, 221-224 (2000).</li>
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<li>Harkness, R. A., Lund, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+concentrations+of+hypoxanthine%2C+xanthine%2C+uridine+and+inosine%3A+high+concentrations+of+the+ATP+metabolite%2C+hypoxanthine%2C+after+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine, xanthine, uridine and inosine: high concentrations of the ATP metabolite, hypoxanthine, after hypoxia.</a> J Clin Pathol. 36, 1-8 (1983).</li>
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<li>Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+methyl+malondialdehyde+as+an+internal+standard+for+malondialdehyde+detection%3A+validation+by+isotope-dilution+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry.</a> Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).</li>
<li>Paroni, R., Fermo, I., Cighetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+methyl+malondialdehyde+as+internal+standard+for+malondialdehyde+detection+by+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Validation of methyl malondialdehyde as internal standard for malondialdehyde detection by capillary electrophoresis.</a> Anal Biochem. 307, 92-98 (2002).</li>
<li>Cighetti, G., Debiasi, S., Ciuffreda, P., Allevi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-ethoxyacrolein+contamination+increases+malondialdehyde+inhibition+of+milk+xanthine+oxidase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Beta-ethoxyacrolein contamination increases malondialdehyde inhibition of milk xanthine oxidase activity.</a> Free Radic Biol Med. 25, 818-825 (1998).</li>
<li>Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+and+total+malondialdehyde+assessment+in+biological+matrices+by+gas+chromatography-mass+spectrometry%3A+what+is+needed+for+an+accurate+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection.</a> Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).</li>
<li>Yamamoto, T., Moriwaki, Y., Takahashi, S., Tsutsumi, Z., Yamakita, J., Nasako, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+human+plasma+xanthine+oxidase+activity+by+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Appl%22%5BJournal%5D)">Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance liquid chromatography.</a> J Chromatogr B Biomed Appl. 681, 395-400 (1996).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbook+of+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22">Handbook of Biochemistry and Molecular Biology</a>. Fasman, G. , 3 ed, CRC Press. Boca Raton. (1988).</li>
<li>Chen, X. B., Calder, A. G., Prasitkusol, P., Kyle, D. J., Jayasuriya, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+15N+isotopic+enrichment+and+concentrations+of+allantoin+and+uric+acid+in+urine+by+gas+chromatography%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Determination of 15N isotopic enrichment and concentrations of allantoin and uric acid in urine by gas chromatography/mass spectrometry.</a> J Mass Spectrom. 33, 130-137 (1998).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os métodos descritos aqui permitir a avaliação da isquemia hipóxia neonatal. Este protocolo combina as medições de marcadores de privação de energia (ATP), stress oxidativo, dano oxidativo e atividade de enzimas para obter uma imagem global bioquímicos da presença ou até mesmo o grau de isquemia hipóxica. Apesar da utilidade deste método, existem limitações em potencial. Em primeiro lugar, que leva cerca de 1-2 ml de sangue para coletar plasma suficiente para executar todos os ensaios. Este não será um problema em adult...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> 6ml K3E EDTA K3 tubo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 2204061 </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga 5702R </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05413319 </td><td> Com 13 e adaptador de 16MM </td></tr><tr><td> Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml </td><td> EUA Scientific </td><td> 1615-5599 </td><td></td></tr><tr><td> 2-aminopurina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3509 </td><td></td></tr><tr><td> Varian Cary 100 espectrofotômetro </td><td> Agilant Technologies </td><td> 0010071500 </td><td></td></tr><tr><td> Savant SpeedVac </td><td> Thermo Scientific </td><td> SC210A-115 </td><td></td></tr><tr><td> Micron dispositivo centrífugo filtro </td><td> Fisher Scientific </td><td> UFC501596 </td><td></td></tr><tr><td> Supelcosil Coluna LC-18-S </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 58931 </td><td></td></tr><tr><td> Supelcosil LC-18-S Supelguard cartucho e titular </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 59629 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC </td><td> Águas </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vial GCMS </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03376607 </td><td></td></tr><tr><td> DL-Alantoína-5 -13 C; 1 -15 N </td><td> CDN Isótopos </td><td> M-2307 </td><td> Lot # L340P9 </td></tr><tr><td> MTBSTFA </td><td> Thermo Scientific </td><td> 48920 </td><td></td></tr><tr><td> Piridina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270970 </td><td></td></tr><tr><td> 5973E GC / MSD </td><td> Agilent Technologies </td><td> G7021A </td><td> Part # 5975E para GC / MS </td></tr><tr><td> 3-Ethoxymethacrolein </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 232548 </td><td></td></tr><tr><td> Hidróxido de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Diclorometano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270997 </td><td></td></tr><tr><td> Benzeno </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401765 </td><td></td></tr><tr><td> Diisopropil éter </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 38270 </td><td></td></tr><tr><td> BHT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B1378 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 459844 </td><td></td></tr><tr><td> Fenil </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P26252 </td><td></td></tr></tbody></table>

medição bioquímicos da hipóxia neonatal

Biochemical Measurement of Neonatal Hypoxia

Isquemia hipóxia neonatal é caracterizada por perfusão sangüínea inadequada de um tecido ou uma falta sistêmica de oxigênio. Esta condição é pensado para causar / agravar bem documentados distúrbios incluindo comprometimento neurológico neonatal 1-3. Trifosfato de adenosina diminuiu a produção ocorre devido à falta de fosforilação oxidativa. Para compensar essa energia moléculas estado privados contendo ligações fosfato de alta energia são duas degradadas. Isso leva a aumento dos níveis de adenosina, que é posteriormente degradado a inosina, hipoxantina, xantina e, finalmente, o ácido úrico. As duas últimas etapas deste processo de degradação são realizadas por xantina oxidoredutase. Esta enzima existe sob a forma de xantina desidrogenase em condições normóxica mas é convertida em xantina oxidase (XO), sob hipóxia-reperfusão circunstâncias 4, 5. Ao contrário de xantina desidrogenase, XO gera peróxido de hidrogênio como um subproduto da degradação da purina 4, 6. Este peróxido de hidrogênio em combinação com outras espécies reativas de oxigênio (ROS) produzidas durante a hipóxia, oxida o ácido úrico a formar alantoína e reage com membranas lipídicas para gerar malondialdeído (MDA) 7-9. A maioria dos mamíferos, os seres humanos isentos, possuem a enzima uricase, que converte ácido úrico em alantoína. Nos seres humanos, no entanto, alantoína só pode ser formado por ROS mediada oxidação do ácido úrico. Devido a isso, alantoína é considerado um marcador de estresse oxidativo em humanos, mas não os mamíferos que têm uricase. Descrevemos os métodos empregando cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e cromatografia gasosa espectrometria de massa (GCMS) para medir marcadores bioquímicos de isquemia hipóxia neonatal. O sangue humano é usado para a maioria dos testes. Sangue animal também pode ser usado, reconhecendo o potencial de uricase gerado alantoína. Metabólitos de purinas estavam ligados à hipóxia já em 1963 ea confiabilidade de hipoxantina, xantina e ácido úrico como indicadores bioquímicos de hipóxia neonatal foi validada por vários pesquisadores 10-13. O método de HPLC utilizado para a quantificação de compostos de purina é rápido, confiável e reprodutível. O método de GC / MS utilizado para a quantificação de alantoína, um marcador relativamente novo de estresse oxidativo, foi adaptado de Gruber et al 7. Este método evita certos artefatos e requer baixos volumes de amostra. Métodos utilizados para a síntese de MMDA foram descritos em outros 14, 15. GC / MS com base quantificação de MDA foi adaptado a partir Paroni et al. e Cighetti et al. 16, 17. Xantina oxidase atividade foi medida por HPLC, quantificando a conversão de pterin para isoxanthopterin 18. Esta abordagem provou ser suficientemente sensível e reprodutível.

Um método é descrito para medir marcadores bioquímicos de hipóxia-isquemia neonatal. A abordagem utiliza cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e Cromatografia Gasosa Espectrometria de Massa (GC / MS).

Medição bioquímicos da Hipóxia Neonatal

A hipóxia-isquemia neonatal é caracterizada por uma perfusão sanguínea inadequada de um tecido ou por uma carência sistêmica de oxigênio. Acredita-se que esta condição...

O objetivo geral do seguinte experimento é medir marcadores bioquímicos de hipóxia-isquemia neonatal. Isso é realizado primeiramente coletando amostras de sangue de recém-nascidos para isolar o plasma. Em seguida, parte do plasma é filtrada, combinada com um padrão interno e analisada quanto às concentrações de hipoxantina, xantina e ácido úrico na HPLC dois.Em seguida, alíquotas de plasma são diferencialmente processadas e analisadas separadamente. Para a concentração de alantoína e níveis de MDA na GCMS, a etapa final do procedimento é combinar uma porção de plasma com um substrato para iniciar a reação enzimática após a interrupção da reação. A atividade da xantina oxidase pode ser determinada em um HPLC equipado com detector de fluorescência.Por fim, são obtidos resultados que mostram cromatogramas de áreas de pico, que podem ser convertidos em concentrações molares dos marcadores bioquímicos desejados ou na atividade enzimática por meio de curvas-padrão. As implicações desta técnica estendem-se ao diagnóstico e tratamento da hipóxia-isquemia neonatal, pois este método combina medições de marcadores de privação energética, estresse oxidativo, dano oxidativo e atividade enzimáti

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Modelos animais de grande porte têm bons valores de translação no exame de fisiologia e farmacologia da asfixia neonatal. Usando leitões recém-nascidos, desenvolvemos um protocolo experimental para simular a asfixia neonatal, que tem as vantagens de estudar a hemodinâmica sistêmica e regional, o transporte de oxigênio com vias bioquímicas e patológicas e correlações.

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Não-invasivo de medição óptica do metabolismo cerebral e Hemodinâmica em Lactentes

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O modelo de fetos de ovelhas não-anestesiado cronicamente instrumentados é usado para estudar o desenvolvimento fetal humano na saúde e na doença, pois permite a colocação cirúrgica e manutenção de cateteres e eletrodos, coleta de sangue repetitivo, injeção de substância, a gravação da atividade bioelétrica, e in vivo de imagens. Nós descrevemos os procedimentos necessários para estabelecer este modelo.

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Apresentamos um protocolo para medir a saturação regional de oxigênio (rSO2) em pacientes em hemodiálise (HD) por meio de um monitor de espectroscopia no infravermelho próximo. O valor de rSO2 é um índice de oxigenação tecidual. Esta monitorização não invasiva e em tempo real pode ser útil para confirmar alterações na oxigenação dos órgãos durante a DH.

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