Name: Medição bioquímicos da Hipóxia Neonatal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Aprenda a medir marcadores bioquímicos de hipóxia neonatal usando HPLC e GC/MS em amostras de plasma de recém-nascidos. Este método permite quantificar hipoxantina, xantina, ácido úrico, alantoína e MDA para diagnóstico precoce.

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Este trabalho é financiado pelo National Institutes of Health NR011209 R01-03

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<li>Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+methyl+malondialdehyde+as+an+internal+standard+for+malondialdehyde+detection%3A+validation+by+isotope-dilution+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry.</a> Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).</li>
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<li>Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+and+total+malondialdehyde+assessment+in+biological+matrices+by+gas+chromatography-mass+spectrometry%3A+what+is+needed+for+an+accurate+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection.</a> Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os métodos descritos aqui permitir a avaliação da isquemia hipóxia neonatal. Este protocolo combina as medições de marcadores de privação de energia (ATP), stress oxidativo, dano oxidativo e atividade de enzimas para obter uma imagem global bioquímicos da presença ou até mesmo o grau de isquemia hipóxica. Apesar da utilidade deste método, existem limitações em potencial. Em primeiro lugar, que leva cerca de 1-2 ml de sangue para coletar plasma suficiente para executar todos os ensaios. Este não será um problema em adult...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> 6ml K3E EDTA K3 tubo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 2204061 </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga 5702R </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05413319 </td><td> Com 13 e adaptador de 16MM </td></tr><tr><td> Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml </td><td> EUA Scientific </td><td> 1615-5599 </td><td></td></tr><tr><td> 2-aminopurina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3509 </td><td></td></tr><tr><td> Varian Cary 100 espectrofotômetro </td><td> Agilant Technologies </td><td> 0010071500 </td><td></td></tr><tr><td> Savant SpeedVac </td><td> Thermo Scientific </td><td> SC210A-115 </td><td></td></tr><tr><td> Micron dispositivo centrífugo filtro </td><td> Fisher Scientific </td><td> UFC501596 </td><td></td></tr><tr><td> Supelcosil Coluna LC-18-S </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 58931 </td><td></td></tr><tr><td> Supelcosil LC-18-S Supelguard cartucho e titular </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 59629 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC </td><td> Águas </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vial GCMS </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03376607 </td><td></td></tr><tr><td> DL-Alantoína-5 -13 C; 1 -15 N </td><td> CDN Isótopos </td><td> M-2307 </td><td> Lot # L340P9 </td></tr><tr><td> MTBSTFA </td><td> Thermo Scientific </td><td> 48920 </td><td></td></tr><tr><td> Piridina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270970 </td><td></td></tr><tr><td> 5973E GC / MSD </td><td> Agilent Technologies </td><td> G7021A </td><td> Part # 5975E para GC / MS </td></tr><tr><td> 3-Ethoxymethacrolein </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 232548 </td><td></td></tr><tr><td> Hidróxido de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Diclorometano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270997 </td><td></td></tr><tr><td> Benzeno </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401765 </td><td></td></tr><tr><td> Diisopropil éter </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 38270 </td><td></td></tr><tr><td> BHT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B1378 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 459844 </td><td></td></tr><tr><td> Fenil </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P26252 </td><td></td></tr></tbody></table>

medição bioquímicos da hipóxia neonatal

Biochemical Measurement of Neonatal Hypoxia

Isquemia hipóxia neonatal é caracterizada por perfusão sangüínea inadequada de um tecido ou uma falta sistêmica de oxigênio. Esta condição é pensado para causar / agravar bem documentados distúrbios incluindo comprometimento neurológico neonatal 1-3. Trifosfato de adenosina diminuiu a produção ocorre devido à falta de fosforilação oxidativa. Para compensar essa energia moléculas estado privados contendo ligações fosfato de alta energia são duas degradadas. Isso leva a aumento dos níveis de adenosina, que é posteriormente degradado a inosina, hipoxantina, xantina e, finalmente, o ácido úrico. As duas últimas etapas deste processo de degradação são realizadas por xantina oxidoredutase. Esta enzima existe sob a forma de xantina desidrogenase em condições normóxica mas é convertida em xantina oxidase (XO), sob hipóxia-reperfusão circunstâncias 4, 5. Ao contrário de xantina desidrogenase, XO gera peróxido de hidrogênio como um subproduto da degradação da purina 4, 6. Este peróxido de hidrogênio em combinação com outras espécies reativas de oxigênio (ROS) produzidas durante a hipóxia, oxida o ácido úrico a formar alantoína e reage com membranas lipídicas para gerar malondialdeído (MDA) 7-9. A maioria dos mamíferos, os seres humanos isentos, possuem a enzima uricase, que converte ácido úrico em alantoína. Nos seres humanos, no entanto, alantoína só pode ser formado por ROS mediada oxidação do ácido úrico. Devido a isso, alantoína é considerado um marcador de estresse oxidativo em humanos, mas não os mamíferos que têm uricase. Descrevemos os métodos empregando cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e cromatografia gasosa espectrometria de massa (GCMS) para medir marcadores bioquímicos de isquemia hipóxia neonatal. O sangue humano é usado para a maioria dos testes. Sangue animal também pode ser usado, reconhecendo o potencial de uricase gerado alantoína. Metabólitos de purinas estavam ligados à hipóxia já em 1963 ea confiabilidade de hipoxantina, xantina e ácido úrico como indicadores bioquímicos de hipóxia neonatal foi validada por vários pesquisadores 10-13. O método de HPLC utilizado para a quantificação de compostos de purina é rápido, confiável e reprodutível. O método de GC / MS utilizado para a quantificação de alantoína, um marcador relativamente novo de estresse oxidativo, foi adaptado de Gruber et al 7. Este método evita certos artefatos e requer baixos volumes de amostra. Métodos utilizados para a síntese de MMDA foram descritos em outros 14, 15. GC / MS com base quantificação de MDA foi adaptado a partir Paroni et al. e Cighetti et al. 16, 17. Xantina oxidase atividade foi medida por HPLC, quantificando a conversão de pterin para isoxanthopterin 18. Esta abordagem provou ser suficientemente sensível e reprodutível.

Um método é descrito para medir marcadores bioquímicos de hipóxia-isquemia neonatal. A abordagem utiliza cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e Cromatografia Gasosa Espectrometria de Massa (GC / MS).

Medição bioquímicos da Hipóxia Neonatal

A hipóxia-isquemia neonatal é caracterizada por uma perfusão sanguínea inadequada de um tecido ou por uma carência sistêmica de oxigênio. Acredita-se que esta condição...

O objetivo geral do seguinte experimento é medir marcadores bioquímicos de hipóxia-isquemia neonatal. Isso é realizado primeiramente coletando amostras de sangue de recém-nascidos para isolar o plasma. Em seguida, parte do plasma é filtrada, combinada com um padrão interno e analisada quanto às concentrações de hipoxantina, xantina e ácido úrico na HPLC dois.Em seguida, alíquotas de plasma são diferencialmente processadas e analisadas separadamente. Para a concentração de alantoína e níveis de MDA na GCMS, a etapa final do procedimento é combinar uma porção de plasma com um substrato para iniciar a reação enzimática após a interrupção da reação. A atividade da xantina oxidase pode ser determinada em um HPLC equipado com detector de fluorescência.Por fim, são obtidos resultados que mostram cromatogramas de áreas de pico, que podem ser convertidos em concentrações molares dos marcadores bioquímicos desejados ou na atividade enzimática por meio de curvas-padrão. As implicações desta técnica estendem-se ao diagnóstico e tratamento da hipóxia-isquemia neonatal, pois este método combina medições de marcadores de privação energética, estresse oxidativo, dano oxidativo e atividade enzimática para gerar uma imagem bioquímica geral da presença e até mesmo do grau de hipóxia-isquemia. Antes do início deste procedimento, uma amostra de sangue humano é coletada de um recém-nascido imediatamente após o nascimento em um tubo de EDTA de seis mililitros em menos de cinco minutos.Após a coleta, centrifugue a amostra a quatro graus Celsius e 1.500 ×g por 10 minutos. Transfira o plasma, que está presente no sobrenadante, para um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro e centrifugue por 30 minutos. Remova o sobrenadante tomando cuidado para não contaminar as amostras com hemácias.Divida as amostras em tubos microcêntrifugos separados para análise de purinas, MDA e xantina oxidase para cada medição de PLC das purinas. Transfira 200 microlitros do plasma para um dispositivo de filtração centrífuga. Centrifugue o plasma a quatro graus Celsius e 14.000 ×g durante 1,5 hora.Remova o filtrado e transfira para um tubo de microcentrífuga contendo duas aino purina. Certifique-se de registrar o volume de filtrado adicionado ao tubo de microcentrífuga contendo duas AP. Para determinar com precisão a concentração, vorte o tubo por 10 a 20 segundos.Analise as amostras por HPLC conforme descrito no protocolo escrito, utilizando três injeções de 50 microlitros para cada amostra a partir dos cromatogramas obtidos. Determine a concentração de purinas na amostra. Quantifique hipoxantina, xantina e ácido úrico obtendo as áreas dos picos nos respectivos tempos de retenção e comprimentos de onda.Em seguida, quantifique a área do pico de duas AP. A partir dessas informações, podem ser calculadas as razões entre as áreas da hipoxantina e do ácido úrico em relação às duas AP. Em seguida, converta as razões em concentrações micromolares utilizando curvas-padrão. Para realizar a medição da lanina, adicione 50 microlitros do padrão interno e 100 microlitros de acetonitrila a 50 microlitros de plasma.Após agitar a mistura em vórtex por 10 a 20 segundos, centrifugue por 10 minutos. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e coloque-o em um vial GCM S.Seque o líquido sob gás nitrogênio. Uma vez que o líquido esteja seco, adicione 25 microlitros do agente de silylação M-T-B-S-T-F-A e 25 microlitros de piridina. Tampe o frasco e incube a 50 graus Celsius por duas horas.Em seguida, transfira a amostra para outro frasco de GCMS com inserção de 300 microlitros. Analise as amostras no GCMS utilizando um amostrador automático. Realize a separação dos compostos usando hélio como gás de arraste com uma vazão de 1,5 mililitro por minuto.Para iniciar a análise por GCMS, insira os parâmetros da corrida. Ajuste a temperatura inicial da coluna para 100 graus Celsius e mantenha essa temperatura por dois minutos antes de aumentá-la para 180 graus Celsius a uma taxa de 10 graus Celsius por minuto. Mantenha a temperatura por quatro minutos, então aumente-a para 260 graus Celsius a uma taxa de 20 graus Celsius por minuto.Mantenha essa temperatura até o final da corrida. Use o amostrador automático para injetar um microlitro do produto DERIVATIZADO em modo split e realize a corrida entre cada análise de amostra. Faça com que o amostrador automático limpe a coluna com duas injeções de uma para uma M-T-B-S-T-F-A piridina.Para quantificar um LAN toin, selecione o modo de monitoramento de íons e monitore o íon com razão de carga 3 98 para o atlanto in e a razão de carga 400 para o atlanto in pesado. Em seguida, converta as razões de abundância iônica de atlanto in para atlanto in pesado em concentrações micromolares de atlanto in utilizando uma curva padrão previamente preparada. Antes da medição de MDA, prepare soluções de tolueno hidroxilado butilado e fenil-hidrazina 50 milimolares conforme descrito no protocolo escrito. ADICIONE M-M-D-A-B-H-T e citrato de sódio à amostra de plasma de 100 microlitros.Dilua a mistura final para 480 microlitros adicionando água destilada desionizada. Derivatize a solução adicionando 20 microlitros de hidrazina fenólica 50 milimolar. Após tampar o vial, incube a solução em um agitador orbital.Após a incubação, adicione um mililitro de hexano, vórtex a mistura por um minuto e centrifugue a 3000 rotações por minuto durante 10 minutos. Após a centrifugação, transfira a camada orgânica para um tubo de microcentrífuga. Em seguida, concentre a solução até 100 microlitros por evaporação sob fluxo de gás nitrogênio e transfira para um vial A-G-C-M-S com inserção de 300 microlitros.Em seguida, analise as amostras em A-G-C-M-S utilizando o amostrador automático, realizando a separação e quantificação do composto MDA conforme descrito no procedimento escrito. Inicie a detecção da atividade da santhe oxidase preparando dois frascos para as amostras de plasma: um para incubação com o substrato por zero minutos como controle, e outro para incubação por quatro horas.Como no experimento, adicione tampão e substrato a cada tubo. Pré-incube as amostras a 37 graus Celsius por cinco minutos. Inicie a reação enzimática adicionando 60 microlitros de plasma a cada tubo.Adicione imediatamente 300 microlitros de ácido perclórico a 4% ao tubo de incubação zero. Por outro lado, deixe a outra mistura incubando por quatro horas a 37 graus Celsius antes de interromper a reação após a adição de ácido perclórico. Agite o tubo-controle de incubação zero em vórtex e, em seguida, submeta-o à centrifugação.Remova 500 microlitros do sobrenadante e adicione-o a um tubo contendo 20 microlitros de carbonato de potássio cinco molar para neutralizar a reação. Vortexe a amostra neutralizada e centrifugue pela segunda vez. Em seguida, adicione 350 microlitros da solução neutralizada a um tubo de microcentrífuga contendo dois ap. Após a incubação da amostra por quatro horas, interrompa a reação adicionando 300 microlitros de ácido perclórico 4%.Continue o processamento da amostra conforme realizado para a amostra controle. Analise as amostras em um CLAE equipado com detector de fluorescência com varredura. Insira os parâmetros utilizando suas condições socráticas com uma vazão de um mililitro por minuto.Para obter separação e identificação adequadas dos picos, ajuste o comprimento de onda de excitação do detector de fluorescência em 340 nanômetros e o comprimento de onda de emissão em 410 nanômetros três 50. São realizadas injeções de microlitros no HPLC para cada amostra após a corrida do HPLC. Determine a razão entre ISO terina e dois AP obtendo as áreas dos picos a partir do espectro do detector de fluorescência.O primeiro pico no espectro em aproximadamente cinco minutos corresponde a duas ap. O segundo e maior pico será terran. O pico do ISO antho terin elui por último, obtenha a diferença nas razões das áreas dos picos ISO ANTOIN e duas AP entre os pontos de tempo de incubação zero e quatro horas.Utilize este valor para calcular a atividade da xantina oxidase a partir das curvas padrão. Um exemplo da quantificação por HPLC de compostos de purina é mostrado; os tempos específicos de retenção e os comprimentos de onda de emissão do ácido úrico, hipoxantina e xantina permitem a quantificação simultânea de compostos de purina. Quando o ensaio é realizado corretamente, os compostos terão separação adequada e a forma dos picos será nítida e unimodal.Se houver bolhas de ar no sistema de CLAE, os tempos de retenção irão se deslocar e a pressão da CLAE irá flutuar drasticamente. Se o cartucho de proteção precisar ser substituído, a pressão aumentará e os picos irão alargar e se tornar bimodais ou trimodais, como mostrado neste exemplo aqui. Um exemplo da quantificação por CG-EM de laninina é apresentado porque a laninina derivatizada maciça e a laninina derivatizada pesada são conhecidas.O modo de seleção iônica pode ser utilizado para identificar esses compostos no espectrômetro de massas. Se o ensaio for realizado corretamente, dois picos serão observados no mesmo tempo de retenção. Um pico corresponde à Alan Toin e o outro à toin pesada.Os resultados da quantificação de MDA são semelhantes aos da Alan Toin, com exceção de que dois picos são observados em tempos de retenção diferentes. Aqui, observa-se um pico de razão de carga principal de 144 para MDA e um pico de razão de carga principal de 158 para MMDA. Um exemplo da quantificação baseada em HPLC da função xantina oxidase é demonstrado no tempo de incubação de zero minuto e no tempo de incubação de quatro horas.Se o ensaio for realizado corretamente, três picos devem ser observados com o detector de fluorescência: um para dois ap, um para Terran e um para ISO terin. Observe que o pico mais alto de ISO terin ocorre após o tempo de incubação de quatro horas, devido ao aumento da atividade da enzima santhe oxidase. Como este ensaio mede a função enzimática, congelamentos e descongelamentos repetidos da amostra podem alterá-la.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir com precisão diversos marcadores bioquímicos de hipóxia-isquemia neonatal.

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A encefalopatia hipóxico-isquêmica após asfixia perinatal pode ser estudada usando modelos animais. Demonstramos os procedimentos necessários para estabelecer um modelo de leitão de encefalopatia hipóxico-isquêmica neonatal.

Um Modelo de Leitão Neonatal encefalopatia hipóxico-isquêmica

Este artigo descreve a metodologia para a administração de curtos períodos de hipóxia intermitente para pós-natal 1-8 dia ratinho ou um rato filhotes. Esta abordagem suscita efectivamente um nível do tecido robusto "efeito priming" sobre as células progenitoras neurais em cultura que são colhidas no prazo de 30 min de exposição hipóxia.

Entrega de<em&gt; In Vivo</em&gt; Aguda intermitente hipóxia em Neonatal Roedores ao primeiro-subventricular Zona derivados de culturas de células progenitoras neurais

O modelo de fetos de ovelhas não-anestesiado cronicamente instrumentados é usado para estudar o desenvolvimento fetal humano na saúde e na doença, pois permite a colocação cirúrgica e manutenção de cateteres e eletrodos, coleta de sangue repetitivo, injeção de substância, a gravação da atividade bioelétrica, e in vivo de imagens. Nós descrevemos os procedimentos necessários para estabelecer este modelo.

Instrumentação de Perto prazo Sheep Fetal para multivariadas crônicas não-anestesiados Recordings

A imagem microcirculatória (IM) é usada para monitorar a perfusão periférica em neonatos gravemente doentes ou prematuros. Este manuscrito e vídeo demonstram a abordagem ideal para obter imagens de alta qualidade.

Transcutânea Microcirculatory Imaging no recém-nascidos pré-termo

Este protocolo foi projetado para auxiliar os médicos a medir a oxigenação do tecido regional em diferentes locais do corpo em bebês e crianças. Pode ser usado em situações em que a oxigenação tecidual é potencialmente comprometida, particularmente durante o bypass cardiopulmonar, ao usar dispositivos de assistência cardíaca não pulsantes, e em recém-nascidos, bebês e crianças em estado crítico.

Como administrar espectroscopia infravermelha em recém-nascidos, bebês e crianças em estado crítico

Apresentamos um protocolo para medir a saturação regional de oxigênio (rSO2) em pacientes em hemodiálise (HD) por meio de um monitor de espectroscopia no infravermelho próximo. O valor de rSO2 é um índice de oxigenação tecidual. Esta monitorização não invasiva e em tempo real pode ser útil para confirmar alterações na oxigenação dos órgãos durante a DH.

Mensuração da Oxigenação Tecidual por Espectroscopia no Infravermelho Próximo em Pacientes em Hemodiálise

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir hipóxia em camundongos neonatais, entregando-os em ambientes controlados com concentrações variáveis de oxigênio. Modelos de camundongos submetidos a variações de oxigênio ao nascimento variaram de forma duradoura a expressão de miRNAs envolvidos na indução de alterações fenotípicas comportamentais, como o autismo.

Hipóxia altera os níveis de miRNAs envolvidos na herança não mendeliana do transtorno do espectro autista em camundongos

Aprenda a medir marcadores bioquímicos de hipóxia neonatal usando HPLC e GC/MS em amostras de plasma de recém-nascidos. Este método permite quantificar hipoxantina, xantina, ácido úrico, alantoína e MDA para diagnóstico precoce.

Medição bioquímicos da Hipóxia Neonatal

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