Isolamento de Ilhotas Humanos de pacientes parcialmente pancreatectomizado

Olá, sou Florian Al, do Departamento de Cirurgia da Universidade Técnica de Triton. Olá, sou Gregor Cher, também do Departamento de Cirurgia do Hospital Universitário. Em Grayston.

A pesquisa sobre a biologia e a função das pálpebras é desesperadamente necessária para avançar nossa compreensão da fisiologia das pálpebras e da patogênese do diabetes. Infelizmente, as pálpebras humanas de pacientes não diabéticos e diabéticos tipo dois são muito difíceis de obter. A sequência de vídeo a seguir mostrará um protocolo de como isolar as pálpebras humanas de pacientes com otimização pancreática parcial.

Os ilhós assim adquiridos podem funcionar como um sistema in vitro para análise funcional. A ressecção cirúrgica do tecido pancreático humano é a pré-condição para o isolamento dos ilhós humanos. Contamos com pacientes submetidos a uma ressecção parcial do pâncreas para patologias pancreáticas específicas.

Como fonte de tecido pancreático humano, o cirurgião corta o pâncreas e realiza a ressecção parcial. Depois, os pescadores pancreáticos são colocados no gelo e levados para o Departamento de Patologia. O patologista determina a quantidade de tecido pancreático mole e de aparência saudável a ser obtido.

Para o isolamento das pálpebras, são necessários pelo menos dois gramas de tecido pancreático para o isolamento. O tecido é colocado em solução ucon e transportado em gelo para o laboratório. O primeiro passo na instalação de isolamento da pálpebra é medir o peso do tecido pancreático.

A amostra é então colocada em um prato de 10 centímetros. Já preparamos um frasco de 500 mililitros com 150 mililitros de mídia RPMI e 1 frasco de 250 mililitros com 130 mililitros de mídia RPMI. Em seguida, adicionamos a solução enzimática de digestão contendo um mililitro de DNAs e 20 mililitros de colagenase ao frasco de 250 mililitros e o colocamos em uma seringa de 10 mililitros.

O tecido pancreático limpo é então distendido pela injeção do meio contendo enzima e picado em pequenos pedaços para aumentar a área de superfície e facilitar o processo de digestão. Esta etapa de picagem é crucial porque a distensão por injeção por si só não permite uma distribuição adequada da enzima dentro do tecido. Paralelamente, montamos o circuito de digestão.

Conforme mostrado nesta figura, a direção do fluxo na câmara registrada é de entrada na parte inferior e de saída na parte superior da câmara. Em seguida, estamos no meio restante contendo enzimas para o frasco de 500 mililitros até um volume de 300 mililitros e, em seguida, inserimos o termômetro. A câmara gravada contém uma malha de metal com um diâmetro pobre de 600 micrômetros e mármores de nitreto de silicone livres com um diâmetro de 15 milímetros cada.

Transferimos o tecido pancreático para a câmara, inserimos a tela, fechamos a câmara e ligamos a bomba com uma velocidade de 140 mililitros por minuto. Quando a temperatura do circuito atinge 37 graus Celsius, começamos a medir o tempo de digestão. A câmara gravada é agitada manualmente de acordo com a composição do tecido.

Para determinar o ponto de tempo ideal para interromper a digestão, coletamos amostras periódicas, manchas de tisona, os ilhós separados vermelhos sob o microscópio. Uma vez que os ilhós parecem estar separados do tecido aino, interrompemos rapidamente a digestão colocando a serpentina de aquecimento no gelo e adicionando 200 mililitros de meio de lavagem a frio ao circuito. Em seguida, coletamos a solução palpebral inserindo o tubo de amostra em falcões de 250 mililitros até que o circuito esteja vazio.

O procedimento de lavagem a seguir começa com a etapa de centrifugação de 1000 RPM a quatro graus Celsius por cinco minutos. Na próxima etapa, descartamos o snat Resus a solução palpebral em meio de lavagem e distribuímos em frações iguais para os falcões de 50 mililitros. A lavagem prossegue com outra etapa de centrifugação de 1000 RPM a quatro graus Celsius por cinco minutos.

Como etapa opcional, distribuímos a paleta em falcões adicionais além dos quatro originais, dependendo do tamanho da paleta. Para melhorar a lavagem, novamente, descartamos o sumidante e soltamos suavemente o palato para separação das pálpebras do tecido aíno. As diferentes densidades de tecido das duas partes permitem a aplicação de um gradiente fecal.

Primeiro, ressuspendemos o pellet em densidade média fecal 1,1 25 gramas por mililitro. O pellet deve ser suficientemente pequeno para permitir uma ressuspensão homogénea. Em seguida, sobrepomos lentamente isso com as densidades da média fecal 1,0 81,0 60 e 1,0 37 com um volume de 10 mililitros cada.

Em seguida, centrifugamos os gradientes a 2.400 RPM por 20 minutos a quatro graus Celsius. Agora você pode distinguir os diferentes componentes separados por suas densidades nas frações. Primeiro, descartamos a camada superior que consiste em gordura e tecido conjuntivo.

A fração que agora coletamos é a primeira camada de agregado palpebral em 1,037 e 1,06, que contém principalmente os ilhós isolados. Para um isolamento eficiente, é importante coletar as frações separadamente. Em seguida, coletamos a fração do agregado da segunda pálpebra na interface de 1,0 60 e 1,0 80, que contém ilhós menos puros do que a primeira camada.

Em seguida, adicionamos o meio de lavagem a um volume total de 50 mililitros para diluir o gradiente fecal e enviamos para FUT a 1000 RPM por cinco minutos. A quatro graus Celsius, descartamos o agente SUP por sucção porque o palato pode estar muito solto devido à mancha de frio. Assim, temos que repetir a etapa de lavagem com meios de cultura de pálpebras a 1000 RPM por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Na última etapa, ressuspendemos os ilhós humanos e a cultura, mídia e cultura dos ilhós. Os ilhós coletados na incubadora a 37 graus Celsius por 24 a 48 horas. Após esta etapa de cultura, as pálpebras estão prontas para processamento posterior.

Este protocolo deve permitir que você isole as pálpebras humanas do tecido pancreático após a pancreatectomia parcial. O transporte rápido e frio dos pescadores pancreáticos para a instalação de isolamento palpebral é importante para preservar a melhor viabilidade celular. A equipe de isolamento deve ter em mente que o processo de digestão é um procedimento altamente dinâmico.

A duração do processo de digestão depende fortemente da composição do tecido. Por exemplo, o grau de fibrose e a capacidade de injeção de enzima suficiente no tecido pancreático. O ajuste individual da força mecânica dentro da câmara registrada e a duração do processo de digestão são cruciais para um bom rendimento palpebral.