Introdução à Técnica Destruição Ultrasound Targeted microbolhas

UTMD significa destruição direcionada por ultrassom de microbolhas. O UTMD pode ser utilizado para direcionar a entrega específica de moléculas bioativas, incluindo genes terapêuticos, a órgãos-alvo acessíveis ao ultrassom, como o coração e o fígado. No UTMD, moléculas bioativas, como plasmídeos com carga negativa, vetores de DNA que codificam um gene de interesse, são adicionadas às camadas catiônicas de agentes de contraste de microbolhas lipídicas; as microbolhas ligadas ao vetor podem ser administradas por via intravenosa ou diretamente no ventrículo esquerdo do coração.

Em animais maiores, eles também podem ser administrados por meio de um cateter coronariano com ou sem período de permanência. A entrega subsequente da circulação para um órgão-alvo ocorre de forma ideal por meio da cavitação acústica em uma frequência de ressonância das microbolhas. É provável que a energia mecânica gerada pela destruição das microbolhas resulte na formação transitória de poros nas células endoteliais ou entre elas, na microvasculatura da região-alvo.

Como resultado desse efeito sauna parion, a eficiência de transfeção nas células endoteliais e através delas é aumentada, e vetores codificadores de transgenes podem ser depositados no tecido circundante de interesse. O DNA plasmático remanescente na circulação é rapidamente degradado por nucleases no sangue durante a preparação das microbolhas. Uma alíquota de uma solução estoque preparada de microbolhas contendo solução salina tampão de glicose fosfato, cloreto de colina fosfatidilcolina tris diol glicerol e diol glicerol tris.

A fosfatidil etanolamina é primeiro incubada a 40 graus Celsius por 15 minutos. A solução aquecida de microbolhas é então transferida para um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo glicerol e entre um e dois miligramas de DNA plasmidial purificado que codifica uma construção de expressão para o gene de interesse. Solução salina tamponada com fosfato é adicionada até um volume final de 500 microlitros.

O ar no microtubo é então substituído por gás octafluoropropano. O microtubo é então agitado vigorosamente em um amalgamador odontológico por 20 segundos. A calibração do equipamento antes do primeiro uso: o transdutor de cavitación UTMD de um megahertz precisa ser calibrado para garantir o índice mecânico e a repetição de pulso adequados.

Um transdutor submerso de um megahertz é conectado a um gerador de forma de onda por meio de um amplificador de potência. O transdutor é colocado em um recipiente de plástico cheio de água, apontado diretamente para um hidrofone, que foi conectado a um osciloscópio por meio de um amplificador de carga; a frequência da forma de onda, a amplitude, o ciclo de rajada e a amplificação de potência podem todos ser modificados para obter o ciclo de trabalho adequado e o índice mecânico ideal para cavitá-las microbolhas. Nesta configuração, calibramos o sistema para um índice mecânico equivalente a aproximadamente 1,3 em um megahertz, com entrega de microbolhas e UTMD antes da administração das microbolhas e U-T-M-D-C 57 BL seis camundongos são anestesiados com 100 miligramas por quilograma de quetamina e cinco miligramas por quilograma de xilazina por injeção intraperitoneal.

A administração de microbolhas é realizada por via intravenosa por meio de injeção direta no ventrículo esquerdo do coração ou por cateterização da veia caudal, sendo esta última demonstrada posteriormente para a injeção cardíaca direta. Um volume de até 100 microlitros da solução de microbolhas carregada com DNA plasmidial é injetado por meio de uma agulha de calibre 30 inserida no quarto espaço intercostal anterior, sob visualização ultrassonográfica, no ventrículo esquerdo do coração. O bolo da solução de microbolhas resultante da injeção intraventricular esquerda é visualizado utilizando um transdutor de ultrassom de alta frequência da VisualSonics posicionado de forma fixa sobre o tórax do camundongo em vista de eixo longo.

Imediatamente após a injeção, realiza-se a destruição das microbolhas por aproximadamente cinco minutos, utilizando um segundo transdutor de menor tamanho e baixa frequência, de 1,0 megahertz, posicionado diretamente sobre o órgão desejado, direcionando a destruição para esta região. O ultrassom é administrado no fígado com uma frequência de repetição de pulso de 1,0 megahertz, índice mecânico equivalente a aproximadamente 1,3 a 1,5 e período de repetição de pulso de 100 milissegundos a cada 20 ciclos, ou o pulso pode ser sincronizado ao ECG do camundongo, com uma rajada de três quadros de ultrassom a cada quatro a seis ciclos cardíacos. Para o método de administração de microbolhas pela veia caudal, o camundongo é anestesiado da mesma forma que para uma seringa contendo o plasmídeo.

Microbolhas ligadas ao DNA são conectadas a um cateter de veia caudal com agulha de 27 gauge. O cateter é inserido no terço distal de uma das veias laterais direita ou esquerda que percorrem a cauda do camundongo. A seringa contendo as microbolhas é colocada em uma bomba de infusão que administrará automaticamente um volume pré-definido uniforme da solução ao longo de um período de tempo predeterminado.

Análise da bioluminescência do UTMD, a eficácia da entrega de DNA plasmidial mediada pelo UTMD pode ser avaliada por meio de diversos métodos, dependendo dos genes codificados no construto. Em particular, a imagem de bioluminescência in vivo é um método que permite monitorar a presença e a duração da expressão gênica em camundongos transfectados com o plasmídeo que codifica um gene repórter de bioluminescência, como a luciferase.

O sistema de imagemagem in vivo Enogen é utilizado para bioluminescência. As imagens são normalmente obtidas de todos os camundongos no primeiro dia após a transfeção mediada por UTMD e são repetidas a cada três a quatro dias até que a expressão gênica da bioluminescência não seja mais detectável visualmente pelo sistema. Para preparar os camundongos para a imagemagem bioluminescente, inicialmente é administrada uma injeção intraperitoneal (IP) do marcador luciferase Lucifer.

Os camundongos são então anestesiados. Aproximadamente três minutos depois, permite-se que a biodistribuição do substrato Lucifer prossiga por cerca de 10 minutos antes que o animal ou os animais sejam colocados na câmara de imagem Xeno Gen e um exame de imagem do corpo inteiro seja realizado durante a aquisição, os fótons emitidos pela reação fotocatalítica da luciferase da luciferina são determinados pelo sistema após cada imagem ser adquirida.

Utilizando o sistema de imagem in vivo Xeno, o software do sistema é usado para medir e quantificar a região visível de interesse luminiscente.