Segmentação Olfactory Neurônios Bulb Usando Combinado In Vivo Eletroporação e Gal4-Based Enhancer Lines Armadilha Zebrafish

Este método ilustra como a combinação de eletroporação in vivo discretamente temporal e espacial com linhagens transgênicas de peixe-zebra pode direcionar seletivamente regiões do embrião em desenvolvimento para expressão de transgenes. Comece com peixes transgênicos cal TA4 derivados pelo método de aprisionamento de potenciador para restringir a expressão gênica e os tipos celulares de interesse. Neste caso, no bulbo olfativo em desenvolvimento em um momento específico do desenvolvimento, injete o plasmídeo repórter GFP na extremidade anterior do prosencéfalo in vivo e realize eletroporação para facilitar a entrega de DNA. Os resultados obtidos por imagem de fluorescência in vivo indicam localização precisa do transgene em um momento e processo específicos do desenvolvimento.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a injeção de plasmídeo no estágio de uma célula, é que a expressão é direcionada a tipos celulares específicos dentro de uma região específica do cérebro em desenvolvimento. Utilize a linhagem transgênica de peixe-zebra criada por meio de um método de armadilha de potenciador mediado para induzir a expressão tanto do fator de transcrição calt A four quanto da proteína repórter M cherry em regiões específicas do cérebro em desenvolvimento. Realize o acasalamento de peixes adultos heterozigotos para a inserção transgênica com peixes selvagens para obter aproximadamente 50% de descendentes transgênicos.

Agora trate embriões transgênicos com 100 micromolar de fenil-tio, iniciando entre seis a oito horas após a fecundação, para inibir a formação de pigmento e facilitar a imagem fluorescente entre 24 e 28 horas após a fecundação. Transfira os embriões para água de ovo sem PTU e, sob microscópio fluorescente, identifique os embriões transgênicos pela expressão de M-cherry no microvaso. Prepare uma solução a 0,5% de agarose de ponto de fusão baixo no tampão de eletroporação acrescido de trica, e em seguida equilibre a solução.

Em uma incubadora de 34 a 37 graus Celsius, coloque uma grande gota, aproximadamente 500 microlitros da solução agro, no centro de uma placa de Petri de 60 milímetros. Usando pinças finas, remova a membrana coriônica de embriões transgênicos. Transfira os embriões liberados para uma placa de Petri contendo tampão de eletroporação mais anestésico trica a 0,02% por dois minutos.

Agora transfira seis a oito embriões anestesiados para a gota preparada de aros utilizando ponteiras de pipeta cortadas do tipo Michael loader. Posicione os embriões de modo que todos estejam voltados na mesma direção e alinhados em uma fileira vertical. Prenda os embriões em posição solidificando o aros com uma grande placa de Petri contendo dois a três milímetros de gelo.

Cubra a placa com tampão de eletroporação contendo trica, garantindo que a solução cubra completamente a gota solidificada de aros. Prepare o plasmídeo purificado de expressão de GFP com corante vermelho de fenol para injeção. Agora, fabrique pipetas de microinjeção utilizando uma ponta de pipeta microloader.

Adicione um a dois microlitros de solução de plasmídeo de DNA à pipeta de injeção, depois monte e fixe a pipeta carregada no suporte da pipeta do sistema de injeção por pressão. Quebre a extremidade da pipeta carregada inserindo-a rapidamente através de um lenço de papel kim submerso até que pulsos de pressão provoquem a liberação POF da solução vermelha de DNA, com a pipeta apontando para a extremidade anterior do cérebro em desenvolvimento. Injete a solução de DNA plasmidial nos ventrículos do cérebro em desenvolvimento por injeção de pressão.

Força o DNA para uma posição adjacente ao bulbo olfativo em desenvolvimento. Injete o DNA até que o corante vermelho seja claramente visível na extremidade anterior do ventrículo do prosencéfalo. Prossiga imediatamente para a etapa de eletroporação para evitar a difusão e diluição do DNA.

Configure o estimulador SD nine para produzir pulsos únicos de eletroporação de cinco milissegundos, a 70 volts. Posicione os eletrodos de modo que o eletrodo positivo fique adjacente à extremidade interior do embrião, enquanto o eletrodo negativo fica posterior à cabeça do embrião.

Inicie manualmente oito pulsos de eletroporação utilizando um único interruptor de mota do estimulador SD nine. Separe cada pulso por um segundo. Deixe os embriões recuperarem por pelo menos 10 minutos.

Agora, utilizando pinças finas, trace suavemente o contorno dos embriões evitando o contato direto com os próprios embriões. Em seguida, libere os embriões do agar. Devolva os embriões à água de ovo e armazene a 28 graus Celsius até a análise da expressão de GFP.

Transfira os embriões para água de ovo contendo anestésico trica a 0,02% por vários minutos, como anteriormente, mas no centro de uma placa de Petri menor de 35 milímetros. Adicione uma grande gota de solução a 0,5% de agarose de ponto de fusão baixa em água de ovo com trica. Em seguida, adicione um embrião anestesiado a esta gota de agarose utilizando ponteiras de micropipeta cortadas.

Posicione o embrião na posição vertical para facilitar uma visão dorsal do cérebro em desenvolvimento sob um microscópio ereto. Solidifique os aros no gelo e use ponteiras de microcarga cortadas para manter a orientação do embrião. Por fim, encha o recipiente com água de ovo acrescida de trica, garantindo que a solução cubra completamente a gota de aro solidificada.

Este exemplo combina a resolução temporal da eletroporação in vivo com uma expressão específica de tipo celular mediada por linhagens transgênicas de armadilha de enhancer para direcionar o bulbo olfativo em desenvolvimento. A linhagem transgênica de armadilha de enhancer exibe expressão constitutiva de m cherry e calt A quatro no cerebelo do cérebro posterior, four brainin e bulbo olfativo em embriões aos cinco dias pós-fertilização. Importante, quatro dias após a eletroporação, as células que expressam GFP mostram projeções axonais típicas de células mitrais do bulbo olfativo.

Essa comparação dos sinais de M Cherry e da menor exposição de GFP demonstra que os corpos celulares que expressam GFP estão de fato localizados no bulbo olfatório utilizando construtos de RNA de interferência em alça curta. Este procedimento também pode ser usado para induzir perda de função em tipos celulares específicos do cérebro em desenvolvimento.