Investigando Motilidade das células ciliadas externas com uma combinação de estimulação de campo externo elétrica alternada de alta velocidade e Análise de Imagem

O objetivo geral deste procedimento é introduzir um método confiável para investigar as respostas motoras das células ciliadas externas ou CCE, incluindo eletromotilidade, motilidade lenta e flexão em frequências acústicas. Isso é realizado primeiramente coletando ossos temporais de cobaias, camundongos ou outros animais mamíferos, e abrindo a bula para expor a cóclea. O segundo passo consiste em imergir a cóclea em Lebovits L 15, removendo a região apical da cápsula óssea, o ligamento espiral e o conduto dos vasos, e removendo o órgão de Corti.

Após uma incubação de cinco minutos do órgão de Corti em colagenase a um miligrama por mililitro, ele é transferido para a câmara de registro usando uma seringa Hamilton de 50 microlitros, e as células são dissociadas fazendo-as passar para frente e para trás pela agulha. A câmara de registro é então levada ao microscópio para estimulação celular com um campo elétrico alternado externo e gravação em vídeo das respostas móveis das células ciliadas externas isoladas com uma câmera de alta velocidade. Por fim, a eletromotilidade, a motilidade lenta e a flexão em frequências acústicas das células ciliadas externas podem ser avaliadas por meio de análise computadorizada de imagens.

Inicie este procedimento coletando os ossos temporais de porquinhos-da-índia, camundongos ou outros modelos animais mamíferos. Em seguida, abra os ossos temporais utilizando pinça de alicate. Para expor a cóclea, remova cuidadosamente o osso em excesso, mantendo intacta a cápsula óssea da cóclea, e imerja-a em L-15 Livi.

Sob o microscópio, abra a região apical da cóclea. Remova o secador, as VASIs e o ligamento espiral com a ponta de uma lâmina de bisturi, um pincel microscópico ou uma pinça fina. Remova o órgão de Corti do modiolo da cóclea utilizando a pinça.

Em seguida, coloque a cóclea em colagenase a um miligrama por mililitro, à temperatura ambiente, durante cinco minutos. Se forem necessárias células ciliadas da região basal da cóclea, remova a cápsula óssea que recobre a base da cóclea com a pinça e separe a espiral do osso temporal utilizando a lâmina de bisturi. Antes de remover o órgão de Corti, transfira o órgão de Corti para a câmara de registro usando uma seringa Hamilton de 50 microlitros. Em seguida, dissocie as células passando-as repetidamente pela agulha.

Aqui está o diagrama do gerador de campo elétrico alternado externo e as conexões com o sistema de captura de imagens, a circuitaria de controle e o software especialmente implementado no núcleo de engenharia do House Ear Institute. A montagem experimental utilizada neste experimento consiste em um microscópio invertido Axia vert 1 3 5 TV com um sistema de iluminação alternativo baseado em LED e dois micromanipuladores eletrônicos. Há três relatórios de câmera no microscópio: uma câmera fotônica ultrarrápida controlada por PC, Fastcam X 10 24 PCI, no teleporte, que possui alta resolução e captura imagens em altas frequências, até 100.000 FPS.

As imagens fornecidas pela câmera de alta velocidade são observadas diretamente no monitor do PC. Uma câmera CCD convencional adicional no porta-ocular está conectada a um monitor de alta resolução. Uma câmera fotográfica digital convencional no porta frontal permite a captura de quadros fixos; um software caseiro em execução no mesmo PC controla o disparo da câmera de alta velocidade, o sistema de iluminação e o campo elétrico alternado externo montado.

Os dois eletrodos, que consistem em dois fios de prata com diâmetro de 0,25 milímetros e distância entre as pontas de 0,8 milímetros, montados em um micromanipulador elétrico. Em seguida, calibre o campo elétrico utilizando um eletrodo externo. Esse eletrodo mede o potencial elétrico em diferentes pontos, gerando um mapa do campo elétrico.

Se uma única célula ciliada externa isolada for colocada entre as pontas dos eletrodos, com seu eixo longitudinal paralelo ao campo elétrico alternado aplicado, ela se move alongando e encurtando na mesma frequência do campo elétrico. Por exemplo, aqui se mostra uma célula sendo estimulada a 50 hertz e gravada a 1000 quadros por segundo. Esta próxima imagem mostra uma célula sendo estimulada a quatro quilohertz e gravada a 18.000 quadros por segundo.

Se a célula for posicionada perpendicularmente ao campo, pode-se observar e investigar um tipo diferente de resposta de flexão nas células ciliadas externas. Esta célula, por exemplo, apresenta flexão quando estimulada em 50 hertz com um campo elétrico perpendicular ao seu eixo maior. As células ciliadas externas podem apresentar alterações na forma em resposta a estímulos não elétricos.

Essa resposta é chamada de motilidade lenta e também pode ser investigada com esta técnica. Selecione diferentes estimulações entre os quatro protocolos diferentes. O primeiro é a frequência simples contínua.

Observe que o modo de estímulo, frequência, amplitude e tipo de onda podem ser selecionados, conforme indicado por círculos vermelhos com o software de controle caseiro. O segundo protocolo de estimulação é a frequência única em rajadas, no qual o comprimento das rajadas e os intervalos entre elas são ajustáveis. O terceiro é a varredura linear, na qual as frequências inicial e final são ajustáveis.

O quarto protocolo de estimulação é a estimulação múltipla, que permite a combinação de diferentes modos de estímulo. Após selecionar os parâmetros correspondentes, o software de controle configura o sistema e permite ao operador iniciar a gravação de vídeo sincronizada com a luz e a estimulação celular com um único clique no botão na tela do computador. Neste vídeo, as células ciliadas externas isoladas exibem mudanças no comprimento ou na curvatura quando são estimuladas com um campo elétrico alternado externo que é paralelo ou transversal, respectivamente, ao seu eixo longitudinal.

As respostas das células ciliadas externas são analisadas posteriormente utilizando a função de rastreamento de características do software Pro Analysts. Aqui é mostrada uma célula ciliada externa estimulada a uma frequência de 50 hertz e registrada a 1000 quadros por segundo. O software fornece a distância entre dois pontos quadro a quadro, conforme mostrado aqui durante a encurtamento celular. A distância entre os pontos selecionados no ápice, indicado em vermelho como placa cuticular, e na base da célula, indicada em verde como polo basal, é menor e aumenta com a alongamento celular. O software realiza uma análise quadro a quadro das alterações no comprimento da célula ciliada externa.

O painel na parte inferior da imagem mostra o rastro do movimento. Neste exemplo, o comprimento total variável é de aproximadamente 6,5 pixels. A seguir, há um exemplo que demonstra que a borda da célula pode ser detectada e a área da seção óptica pode ser medida automaticamente pela função de rastreamento de contorno com o software pro analys.

Neste experimento, microesferas de poliestireno são adicionadas à solução banho de forma aleatória e se ligam firmemente à membrana plasmática. Diferentes microesferas podem ser selecionadas simultaneamente e o software pode rastrear automaticamente todas elas quadro a quadro. Dessa forma, as células podem ser divididas em seções, e a mobilidade de cada seção pode ser avaliada independentemente.

Ao selecionar as microesferas localizadas nas bordas laterais da célula, é possível avaliar independentemente as alterações na imagem do comprimento de cada segmento e as alterações no ângulo de um segmento em relação ao outro. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em três horas, se for executada corretamente.

É claro que é necessário tempo adicional para a análise off-line dos filmes gravados. No entanto, com um software adequado, essa análise pode ser concluída em aproximadamente três horas a mais por filme. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como investigar as respostas motoras das células ciliadas externas, incluindo eletromotilidade, motilidade lenta e flexão em frequências acústicas.