Name: Investigando Motilidade das células ciliadas externas com uma combinação de estimulação de campo externo elétrica alternada de alta velocidade e Análise de Imagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprenda a investigar a motilidade das células ciliadas externas usando estimulação elétrica alternada de alta velocidade e análise de imagem. Este método permite avaliar respostas motéis em frequências acústicas.

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Trabalho apoiado pelo National Institutes of Health Grants R01DC10146/R01DC010397, NIDCD P30 Núcleo de Pesquisa DC006276 e IES. Seu conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do NIH ou IES. Os autores declaram que não há conflito real ou potencial de interesse.

1. Isolamento de CCE <ol><li> Iniciar este procedimento colhendo ossos temporais de cobaias, ratos ou o seu modelo de mamíferos. </li><li> Em seguida, abra os ossos temporais usando uma pinça martelo, a fim de expor a cóclea, e mergulha-as na Leibovitz L-15. Remover o excesso de osso com cuidado, mantendo a casca óssea intacta. Considerando que este é um procedimento geral aplicável aos ossos temporais de qualquer espécie de mamíferos, pequenas mudanças com a técnica pode ser necessária quando se lida com ossos de animais muito pequenos. Em animais velhos a bula é geralmente calcificada, introduzindo uma complicação adicional ao procedimento. </li><li> Sob observação microscópica, abrir a região apical da cóclea e remover estria vascular e ligamento espiral com a ponta de uma lâmina de bisturi # 11, um ponto de micro e pegar uma pinça fina. </li><li> Leve o Órgão de Corti fora do modíolo coclear usando a pinça, e colocá-lo em colagenase 1mg/ml em L-15 em temperatura ambiente por 5 min. </li><li> Se CCEs do giro basal da cóclea são necessários, retire a casca óssea cobrindo a base da cóclea com a picareta, e separar a espiral a partir do osso temporal usando a lâmina de bisturi antes de remover o órgão de Corti. </li><li> Transferir o órgão de Corti para a câmara de gravação usando uma seringa de 50 mL Hamilton. Depois, as células se dissociam pelo refluxo através da agulha. </li></ol> 2. Instalação Experimental <ol><li> Diagrama do gerador de campo elétrico externo alternada (EAEF) e suas ligações com o sistema de captação de imagem (Fig. 1). O circuito de controle foi especialmente implementado no Núcleo de Engenharia do House Ear Institute. </li><li> A configuração experimental utilizada em nossos experimentos consiste de um microscópio 135TV Axiovert invertido (Zeiss, Thornwood, NY) com um sistema de iluminação alternativa baseada em LED (High Power LED System-36AD3500, Lightspeed Technologies, Campbell, CA), dois micromanipuladores eletrônico (Eppendorf "PatchMan", Alemanha), um PC ultra-controlado de alta velocidade Photron FASTCAM X 1024 PCI da câmera (Photron EUA Inc.) no porto Keller e uma câmera CCD adicionais regulares no porto trinocular. A câmera FASTCAM é capaz de capturar imagens em altas freqüências (até 100.000 fps) e alta resolução (por exemplo, 1024 x 1024 pixels a 1000 fps, 512 x 128, 10.000 fps, 384 x 96 em 18.000 fps, e assim por diante). As imagens fornecidas pela câmera de alta velocidade são diretamente observados no monitor de PC, enquanto a câmera CCD está conectado a um monitor diferente. O sistema de iluminação baseada em LED funciona em dois modos diferentes: analógico de baixa potência e alta potência digital. Todos os procedimentos preliminares (posicionamento de eletrodos, posicionamento de célula, foco, etc) são realizadas usando o modo de baixa potência analógico. A iluminação de alta potência é ligado pela abertura do obturador da câmera e, então, desligado pelo fechamento do obturador, facilitando a dissipação de calor. Software caseiro, também desenvolvido no Instituto House Ear Núcleo de Engenharia, em execução no PC mesmo controla o disparo da câmera de alta velocidade, o sistema de iluminação baseados em LEDs, e as EAEF. Uma câmera de foto digital convencional na porta frontal permite ainda os quadros conforme necessário. (Fig. 2 A). </li><li> Eletrodos (dois fios 0,25 mm de diâmetro-Ag com a distância da ponta de 0,8 mm) são levados a posição usando um dos micromanipuladores eletrônicos. Posição eletrodos é monitorada visualmente e por meio da imagem microscópica; uma mudança no plano focal da imagem indica que os eletrodos tocou o fundo da câmara experimental. Inicialmente, o campo elétrico é calibrado usando um eletrodo externo. Este eletrodo mede o potencial elétrico em pontos diferentes, gerando um "mapa" do campo elétrico. Se uma célula do cabelo isolado exterior é colocado entre as pontas dos eletrodos com o seu paralelo eixo longitudinal ao EAEF aplicado, ele se moverá alongamento e encurtamento na mesma freqüência do campo elétrico. Se a célula é colocado perpendicular ao campo um tipo diferente de resposta OHC (flexão) podem ser observados e investigados. (Fig. 2 B) </li></ol> 3. EAEF estimulação e captação de imagem <ol><li> Quatro diferentes protocolos de estimulação são selecionáveis ​​(Fig. 3): <ol><li> freqüência única e contínua (Fig. 3 A). Note-se que tipo de modo de estímulo, freqüência, amplitude e onda pode ser selecionado usando o home-made software de controle (círculos vermelhos). </li><li> única freqüência bursted (Fig. 3 B). O comprimento das explosões e as lacunas entre estourou também são selecionáveis. </li><li> linear de varredura (Fig. 3 C). As freqüências inicial e final são selecionáveis. </li><li> múltiplas-estimulação (Fig. 3 D). Freqüência única e varre linear podem ser combinados em um único experimento. Depois de selecionar os parâmetros correspondentes, o software de controle e configura o sistema permite ao operador iniciar-luz de gravação de vídeo sincronizados e estimulação de células, clicando em um único botão notela do computador. </li></ol></li><li> As imagens são capturadas em formato AVI, para posterior análise em altas freqüências. </li></ol> 4. Resultados representante <ol><li> Neste filme, dois isolados células ciliadas externas mostram mudanças no comprimento ou curvatura quando estão sendo estimuladas com um campo elétrico externo alternada que é paralela ou transversal, respectivamente, ao seu eixo longitudinal. (Filme # 2). </li><li> Respostas CCE móveis são analisados ​​off-line utilizando software ProAnalyst (Xcitex Inc., Cambridge, MA). "Feature Tracking" função neste software fornece a distância entre dois pontos de quadro a quadro (Fig. 4). Durante célula encurtando a distância entre os pontos selecionados no (placa cuticular; cor vermelha) ápice ea base da célula (pólo Basal; cor verde) é menor, e aumenta com o alongamento das células. O filme mostra o software análise quadro a quadro-a mudanças no comprimento. O painel na parte inferior da imagem mostra o traço do movimento. Neste exemplo, a variação total de comprimento é de cerca de 6,5 pixels. </li><li> "Contour Tracking" função no software ProAnalyst pode detectar automaticamente borda da célula e medir a área da secção óptica (Fig. 5). </li><li> Microesferas de poliestireno adicionado à solução de banho de forma aleatória e com firmeza anexar à membrana plasmática (Fig. 6 A). Microesferas diferentes podem ser selecionados simultaneamente, eo software pode rastrear automaticamente todos eles quadro a quadro. Desta forma, as células podem ser divididos em seções e da motilidade de cada seção avaliada de forma independente. (Fig. 6 A) </li><li> Ao selecionar microesferas localizados nas bordas laterais da imagem celular, mudanças no comprimento de cada segmento e as mudanças no ângulo de um segmento que diz respeito a outros (flexão) também pode ser avaliada de forma independente. (Fig. 6B) </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagrama do gerador EAEF e suas ligações com o sistema de captura de imagem. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Imagem A) da instalação experimental. B) Detalhe da etapa de microscópio, com charges dos eletrodos e um OHC única colocada entre eles com o seu paralelo eixo longitudinal ao campo elétrico. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. A interface de usuário) do software de controle caseiro configurado para uma única freqüência de estimulação. Os parâmetros selecionados estão circulados em vermelho. B) interface de usuário da home-made software de controle configurado para estourar única freqüência de estimulação. C) interface de usuário da home-made software de controle configurado para a estimulação de varredura linear. D) interface de usuário do software de controle caseiro configurado para estimulação multi. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Quadro único de um OHC com dois pontos selecionados na base (verde) eo ápice (vermelho) da célula, respectivamente, usando o "recurso de rastreamento" função do software ProAnalyst. A curva abaixo da célula mostra a mudanças periódicas na distância entre os pontos selecionados associados com estimulação elétrica. Movendo a barra vertical frames diferentes podem ser selecionadas para análise individual. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. O "Contour Tracking" em função ProAnalyst detecta a borda da célula e automaticamente medir a área da secção óptica. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Uma imagem) Capturado de um OHC isoladas decorados com microesferas de poliestireno (superior), ea mesma imagem com cinco microesferas selecionadas individualmente (em baixo). Uma cor diferente foi designado para cada micro, e seus deslocamentos podem ser individualmente e automaticamente quadro a quadro rastreados, analisados ​​e comparados. B) Segmentos de comprimento arbitrário pode ser definido por escolha de poliestireno microesferas localizados nas bordas da célula, e as alterações no comprimento destes segmentos, bem como alterações na orientação de um segmento que diz respeito aos outros (célula dobra) pode ser automaticamente avaliado quadro a quadro com o software de análise de imagem. Filme 1. Isolamento de CCEs cobaia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie1_web.mov">Clique aqui para assistir ao vídeo</a> Filme 2. CCE paralelas e perpendiculares ao EAEF mostrando eletromotilidade típicos e respostas flexão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie2_web.mov">Clique aqui para assistir ao vídeo</a>

<ol><li>Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+insights+into+the+morphogenesis+of+inner+ear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells.</a> Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).</li>
<li>Ashmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+outer+hair+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cochlear outer hair cell motility.</a> Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).</li>
<li>Dallos, P., Fakler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prestin%2C+a+new+type+of+motor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prestin, a new type of motor protein.</a> Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3, 104-111 (2002).</li>
<li>Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+outer+hair+cell+bending+in+an+external+electrical+field%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cochlear outer hair cell bending in an external electrical field.</a> Biophys. J. 73, 1665-1672 (1997).</li>
<li>Matsumoto, N., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+Prestin-Dependent+and+Prestin-Independent+Components+from+Complex+Motile+Responses+in+Guinea+Pig+Outer+Hair+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Extraction of Prestin-Dependent and Prestin-Independent Components from Complex Motile Responses in Guinea Pig Outer Hair Cells.</a> Biophys J. 89, 4343-4351 (2005).</li>
<li>Matsumoto, N., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prestin-dependent+and+prestin-independent+motility+of+guinea+pig+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Prestin-dependent and prestin-independent motility of guinea pig outer hair cells.</a> Hear Res. 208, 1-12 (2005).</li>
<li>Ashmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+remarkable+cochlear+amplifier%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">The remarkable cochlear amplifier.</a> Hear Res. 266, 1-17 (2010).</li>
<li>Kitani, R., Kakehata, S., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motile+responses+of+cochlear+outer+hair+cells+stimulated+with+an+alternating+electrical+field%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Motile responses of cochlear outer hair cells stimulated with an alternating electrical field.</a> Hearing Research. , (2011).</li>
<li>Dallos, P., Evans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+outer+hair+cell+motility%3A+corrections+and+addendum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-frequency outer hair cell motility: corrections and addendum.</a> Science. 268, 1420-1421 (1995).</li>
<li>Frank, G., Hemmert, W., Gummer, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+dynamics+of+high-frequency+electromechanical+transduction+in+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Limiting dynamics of high-frequency electromechanical transduction in outer hair cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 4420-4425 (1999).</li>
<li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+frequency+limit+and+phase+of+outer+hair+cell+motility%3A+effects+of+the+membrane+filter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the frequency limit and phase of outer hair cell motility: effects of the membrane filter.</a> J. Neurosci. 12, 1906-1916 (1992).</li>
<li>Inoué, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInou%C3%A9%2C+S+%22Video+Microscopy%22">Video Microscopy</a>. , Plenum Press. New York. (1986).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método experimental aqui apresentado permite estimar respostas OHC móveis na faixa de kHz sem qualquer restrição ao movimento da célula. Protocolos de estimulação diferentes, marcadores adicionais (microesferas), bem como alterações na orientação da célula em relação ao campo elétrico, torná-lo possível investigar novos aspectos da motilidade das CCE, com um nível de detalhes anteriormente inacessíveis. Outros métodos, por exemplo, aqueles que usam fotodiodos 9 ou laser Doppler vibrometria 10, re...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 </td><td> Gibco </td><td> 21083 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenase (tipo 4) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5138 </td><td> 1mg/mL em L-15 </td></tr></tbody></table>

investigando motilidade das células ciliadas externas com uma combinação de estimulação de campo externo elétrica alternada de alta velocidade e análise de imagem

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

CCE são células cilíndricas sensório-motor localizado no órgão de Corti, o órgão auditivo dentro do ouvido dos mamíferos interior. O nome de &quot;células ciliadas&quot; deriva do seu pacote característica apical de estereocílios, um elemento crítico para a detecção e transdução de energia sonora 1. CCE são capazes de mudar de forma-alongado, encurtar e dobre-em resposta à estimulação elétrica, mecânica e química, uma resposta motora considerada crucial para a amplificação coclear dos sinais acústicos 2. Estimulação OHC induz duas diferentes respostas motile: i) eletromotilidade, motilidade rápida aka, mudanças no comprimento na faixa de microssegundos derivados com motor eléctrico mudanças conformacionais em proteínas motoras densamente no OHC membrana plasmática, e ii) a motilidade lenta, muda de forma no milissegundos para segundos gama envolvendo reorganização do citoesqueleto 2, 3. OHC de flexão é associado com eletromotilidade, e resultar tanto de uma distribuição assimétrica de proteínas motoras na membrana plasmática lateral, ou estimulação elétrica assimétrica dessas proteínas motoras (por exemplo, com um campo elétrico perpendicular ao eixo longitudinal das células) 4. Estímulos mecânicos e químicos induzem essencialmente lento respostas móveis, mesmo que as mudanças nas condições iônica das células e / ou seu ambiente também podem estimular a membrana plasmática-embedded do motor proteínas 5, 6. Desde respostas OHC móveis são um componente essencial do amplificador coclear, a análise qualitativa e quantitativa dessas respostas móveis em freqüências acústicas (cerca de 20 Hz a 20 kHz em humanos) é um assunto muito importante no campo da audição investigação 7. O desenvolvimento da nova tecnologia de imagem que combina alta velocidade câmeras de vídeo, sistemas baseados em LEDs de iluminação, e software de análise sofisticada imagem agora fornece a capacidade de executar qualitativa confiável e estudos quantitativos da resposta móveis de CCEs isolado a um campo elétrico externo alternada (EAEF) 8. Esta é uma técnica simples e não invasivo, que contorna a maioria das limitações das abordagens anteriores 9-11. Além disso, o sistema de iluminação baseada em LED proporciona brilho extremo com insignificantes efeitos térmicos nas amostras e, por causa do uso de microscopia de vídeo, resolução óptica é de pelo menos 10 vezes maior do que com as técnicas convencionais de microscopia de luz 12. Por exemplo, com a configuração experimental descrito aqui, mudanças no comprimento das células de cerca de 20 nm pode ser rotineiramente e de forma confiável detectados em freqüências de 10 kHz, e esta resolução pode ser melhorada em freqüências mais baixas. Estamos confiantes de que essa abordagem experimental ajudará a ampliar nossa compreensão dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes a motilidade das CCE.

Um método confiável para investigar células ciliadas externas (CCE) respostas móveis, incluindo eletromotilidade, motilidade lenta e flexão, é descrito. Motilidade das CCE é eliciada pela estimulação com um campo elétrico externo alternada, eo método tira proveito da alta velocidade de gravação de imagem, baseada em LED, iluminação e de última geração de software de análise de imagem.

Investigando Motilidade das células ciliadas externas com uma combinação de estimulação de campo externo elétrica alternada de alta velocidade e Análise de Imagem

As OHCs são células sensorio-motoras cilíndricas localizadas no Órgão de Corti, o órgão auditivo dentro da orelha interna de mamíferos. O nome "células ciliadas" deriva...

O objetivo geral deste procedimento é introduzir um método confiável para investigar as respostas motoras das células ciliadas externas ou CCE, incluindo eletromotilidade, motilidade lenta e flexão em frequências acústicas. Isso é realizado primeiramente coletando ossos temporais de cobaias, camundongos ou outros animais mamíferos, e abrindo a bula para expor a cóclea. O segundo passo consiste em imergir a cóclea em Lebovits L 15, removendo a região apical da cápsula óssea, o ligamento espiral e o conduto dos vasos, e removendo o órgão de Corti.Após uma incubação de cinco minutos do órgão de Corti em colagenase a um miligrama por mililitro, ele é transferido para a câmara de registro usando uma seringa Hamilton de 50 microlitros, e as células são dissociadas fazendo-as passar para frente e para trás pela agulha. A câmara de registro é então levada ao microscópio para estimulação celular com um campo elétrico alternado externo e gravação em vídeo das respostas móveis das células ciliadas externas isoladas com uma câmera de alta velocidade. Por fim, a eletromotilidade, a motilidade lenta e a flexão em frequências acústicas das células ciliadas externas podem ser avaliadas por meio de análise computadorizada de imagens.Inicie este procedimento coletando os ossos temporais de porquinhos-da-índia, camundongos ou outros modelos animais mamíferos. Em seguida, abra os ossos temporais utilizando pinça de alicate. Para expor a cóclea, remova cuidadosamente o osso em excesso, mantendo intacta a cápsula óssea da cóclea, e imerja-a em L-15 Livi.Sob o microscópio, abra a região apical da cóclea. Remova o secador, as VASIs e o ligamento espiral com a ponta de uma lâmina de bisturi, um pincel microscópico ou uma pinça fina. Remova o órgão de Corti do modiolo da cóclea utilizando a pinça.Em seguida, coloque a cóclea em colagenase a um miligrama por mililitro, à temperatura ambiente, durante cinco minutos. Se forem necessárias células ciliadas da região basal da cóclea, remova a cápsula óssea que recobre a base da cóclea com a pinça e separe a espiral do osso temporal utilizando a lâmina de bisturi. Antes de remover o órgão de Corti, transfira o órgão de Corti para a câmara de registro usando uma seringa Hamilton de 50 microlitros. Em seguida, dissocie as células passando-as repetidamente pela agulha.Aqui está o diagrama do gerador de campo elétrico alternado externo e as conexões com o sistema de captura de imagens, a circuitaria de controle e o software especialmente implementado no núcleo de engenharia do House Ear Institute. A montagem experimental utilizada neste experimento consiste em um microscópio invertido Axia vert 1 3 5 TV com um sistema de iluminação alternativo baseado em LED e dois micromanipuladores eletrônicos. Há três relatórios de câmera no microscópio: uma câmera fotônica ultrarrápida controlada por PC, Fastcam X 10 24 PCI, no teleporte, que possui alta resolução e captura imagens em altas frequências, até 100.000 FPS.As imagens fornecidas pela câmera de alta velocidade são observadas diretamente no monitor do PC. Uma câmera CCD convencional adicional no porta-ocular está conectada a um monitor de alta resolução. Uma câmera fotográfica digital convencional no porta frontal permite a captura de quadros fixos; um software caseiro em execução no mesmo PC controla o disparo da câmera de alta velocidade, o sistema de iluminação e o campo elétrico alternado externo montado.Os dois eletrodos, que consistem em dois fios de prata com diâmetro de 0,25 milímetros e distância entre as pontas de 0,8 milímetros, montados em um micromanipulador elétrico. Em seguida, calibre o campo elétrico utilizando um eletrodo externo. Esse eletrodo mede o potencial elétrico em diferentes pontos, gerando um mapa do campo elétrico.Se uma única célula ciliada externa isolada for colocada entre as pontas dos eletrodos, com seu eixo longitudinal paralelo ao campo elétrico alternado aplicado, ela se move alongando e encurtando na mesma frequência do campo elétrico. Por exemplo, aqui se mostra uma célula sendo estimulada a 50 hertz e gravada a 1000 quadros por segundo. Esta próxima imagem mostra uma célula sendo estimulada a quatro quilohertz e gravada a 18.000 quadros por segundo.Se a célula for posicionada perpendicularmente ao campo, pode-se observar e investigar um tipo diferente de resposta de flexão nas células ciliadas externas. Esta célula, por exemplo, apresenta flexão quando estimulada em 50 hertz com um campo elétrico perpendicular ao seu eixo maior. As células ciliadas externas podem apresentar alterações na forma em resposta a estímulos não elétricos.Essa resposta é chamada de motilidade lenta e também pode ser investigada com esta técnica. Selecione diferentes estimulações entre os quatro protocolos diferentes. O primeiro é a frequência simples contínua.Observe que o modo de estímulo, frequência, amplitude e tipo de onda podem ser selecionados, conforme indicado por círculos vermelhos com o software de controle caseiro. O segundo protocolo de estimulação é a frequência única em rajadas, no qual o comprimento das rajadas e os intervalos entre elas são ajustáveis. O terceiro é a varredura linear, na qual as frequências inicial e final são ajustáveis.O quarto protocolo de estimulação é a estimulação múltipla, que permite a combinação de diferentes modos de estímulo. Após selecionar os parâmetros correspondentes, o software de controle configura o sistema e permite ao operador iniciar a gravação de vídeo sincronizada com a luz e a estimulação celular com um único clique no botão na tela do computador. Neste vídeo, as células ciliadas externas isoladas exibem mudanças no comprimento ou na curvatura quando são estimuladas com um campo elétrico alternado externo que é paralelo ou transversal, respectivamente, ao seu eixo longitudinal.As respostas das células ciliadas externas são analisadas posteriormente utilizando a função de rastreamento de características do software Pro Analysts. Aqui é mostrada uma célula ciliada externa estimulada a uma frequência de 50 hertz e registrada a 1000 quadros por segundo. O software fornece a distância entre dois pontos quadro a quadro, conforme mostrado aqui durante a encurtamento celular. A distância entre os pontos selecionados no ápice, indicado em vermelho como placa cuticular, e na base da célula, indicada em verde como polo basal, é menor e aumenta com a alongamento celular. O software realiza uma análise quadro a quadro das alterações no comprimento da célula ciliada externa.O painel na parte inferior da imagem mostra o rastro do movimento. Neste exemplo, o comprimento total variável é de aproximadamente 6,5 pixels. A seguir, há um exemplo que demonstra que a borda da célula pode ser detectada e a área da seção óptica pode ser medida automaticamente pela função de rastreamento de contorno com o software pro analys.Neste experimento, microesferas de poliestireno são adicionadas à solução banho de forma aleatória e se ligam firmemente à membrana plasmática. Diferentes microesferas podem ser selecionadas simultaneamente e o software pode rastrear automaticamente todas elas quadro a quadro. Dessa forma, as células podem ser divididas em seções, e a mobilidade de cada seção pode ser avaliada independentemente.Ao selecionar as microesferas localizadas nas bordas laterais da célula, é possível avaliar independentemente as alterações na imagem do comprimento de cada segmento e as alterações no ângulo de um segmento em relação ao outro. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em três horas, se for executada corretamente.É claro que é necessário tempo adicional para a análise off-line dos filmes gravados. No entanto, com um software adequado, essa análise pode ser concluída em aproximadamente três horas a mais por filme. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como investigar as respostas motoras das células ciliadas externas, incluindo eletromotilidade, motilidade lenta e flexão em frequências acústicas.

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Neurociência

Whole-cell patch-clamp gravações de dendritos do nervo auditivo fibra no interior da fita sinapse das células ciliadas da cóclea de mamíferos.

Gravações pós-sinápticos em Dendrites aferente entrar em contato com células ciliadas da cóclea: Release multivesiculares Monitoramento em uma fita Synapse

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Registro combinado de saída aferente mecanicamente estimulada e marcação de terminais nervosos em folículos pilosos de camundongos

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É apresentada uma técnica simples e inovadora para registrar a descarga aferente devido à estimulação mecânica dos terminais lanceolados das terminações paliçadas que inervam os folículos pilosos da pele da orelha do camundongo.

Gravação combinado de saída Mecanicamente Stimulated aferentes e Nerve Terminal Rotulagem no mouse do folículo piloso Lanceolate Endings

Aqui descrevemos uma nova preparação para imagens de terminais sensoriais lanceolados vivos de terminações paliçadas que inervam os folículos pilosos da pele da orelha de camundongo durante a coloração e descoloração com corantes de estiril piridínio.

Monitoramento óptico do nervo Viver Terminal Etiquetagem na folículo piloso Lanceolate Endings da<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse pele da orelha

(Rana catesbeiana) sacculus da rã-touro americana permite o exame direto da fisiologia das células do cabelo. Aqui a dissecação e preparação de sacculus da rã-touro para estudos biofísicos é descrito. Mostramos experimentos representativos dessas células ciliadas, incluindo o cálculo da relação força-deslocamento de um bundle e medição do seu movimento não forçada.

Preparação fisiológica das células ciliadas do sáculo da Bullfrog americano (<em&gt; Catesbeiana de Rana</em&gt;)

Este protocolo descreve métodos para gravar a resposta auditiva do tronco encefálico de filhotes pós-natal. Para examinar o desenvolvimento funcional de células exteriores do cabelo, o procedimento experimental da braçadeira do remendo de células inteiras gravação em células isoladas de cabelo exteriores é descrito passo a passo.

Auditivo de tronco encefálico e exterior cabelo célula célula inteira Patch Clamp gravação em ratos pós-natal

O peixe-zebra é um sistema de modelo que tem muitos recursos valiosos, incluindo claridade ótica, rápido desenvolvimento externo e, de particular importância para o campo de audição e equilíbrio, localizado externamente células sensoriais do cabelo. Este artigo descreve como transgênico zebrafish pode ser usado para ensaiar tanto cabelo-célula mechanosensation e função pré-sináptica em toto.

Na imagem latente de cálcio Vivo de células de cabelo linha Lateral no Zebrafish Larval

Aqui apresentamos um protocolo para a Microscopia de Condução de Íons da Sonda Hopping (HPICM), uma técnica de sonda de varredura sem contato que permite imagens nanoescala de feixes de estereócilia em células ciliadas auditivas vivas.

Imagem do pacote de esterecilia com resolução de nanoescala em células capilares auditivas de mamíferos vivos

Aprenda a investigar a motilidade das células ciliadas externas usando estimulação elétrica alternada de alta velocidade e análise de imagem. Este método permite avaliar respostas motéis em frequências acústicas.

Investigando Motilidade das células ciliadas externas com uma combinação de estimulação de campo externo elétrica alternada de alta velocidade e Análise de Imagem (Vídeo) | JoVE Journal

Investigando Motilidade das células ciliadas externas com uma combinação de estimulação de campo externo elétrica alternada de alta velocidade e Análise de Imagem

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