Name: Geração robusto de Hepatócito-like Células de populações humanas células-tronco embrionárias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Aprenda a gerar hepatócitos funcionais a partir de células-tronco embrionárias humanas com eficiência de 90%. Este método robusto permite estudar biologia hepática in vitro e testar toxicidade de fármacos.

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Dr Hay foi apoiado por uma bolsa RCUK, o Dr. West foi apoiado pelo Departamento de Cirurgia, Dr. Medine foi apoiado por uma subvenção do Fundo Núcleo BHF, o Sr. Baltasar Lucendo-Villarin foi apoiado por um PhD MRC Studenship. Dr. Zhou foi apoiado por uma bolsa do governo chinês.

<ol><li>Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+a+new+era+for+hepatology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology.</a> J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).</li>
<li>Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+Screening+of+Polymer+Libraries+to+Define+Novel+Substrates+for+Functional+Hepatocytes+with+Inducible+Drug+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism.</a> Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).</li>
<li>Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+Functional+Hepatocyte+Like+Cells+in+Immune+Compromised+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice.</a> Liver International. 31, 254-262 (2011).</li>
<li>Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocyte+Like+Cells+and+their+Potential+in+Toxicity+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening.</a> Toxicology. 278, 250-255 (2010).</li>
<li>Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Stem+Cell+Derived+Hepatic+Endoderm+in+Human+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).</li>
<li>Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Comparison+between+Conditioned+Media+and+Serum+Free+Media+in+Human+Embryonic+Stem+Cell+Culture+and+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation.</a> Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).</li>
<li>Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+Future+Challenges+in+Stem+Cell-Derived+Liver+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).</li>
<li>Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Differentiation+of+hESCs+to+Functional+Hepatic+Endoderm+Requires+ActivinA+and+Wnt3a+Signalling%5BTitle%5D)+AND+%22+Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).</li>
<li>Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inhibitory+Role+of+Stromal+Cell+Mesenchyme+on+Human+Embryonic+Stem+Cell+Hepatocyte+Differentiation+is+Overcome+by+Wnt3a+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+and+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment.</a> Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós desenvolvemos um modelo simples, homogêneo e altamente reprodutível in vitro para gerar níveis escalável de HLCS humana. Nosso modelo foi validado por uma série de laboratórios colaboradores externos. Rotineiramente caracterizar HLCS com células-tronco derivadas usando a nossa caixa de ferramentas na casa de marcadores específicos de desenvolvimento e testes funcionais do fígado (a maioria dos quais estão disponíveis comercialmente). As fases críticas em nosso processo são: a manutenção da pluripotência das...

Placas de revestimento Matrigel e frascos <ol><li> Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); armazenar a -20 ° C. </li><li> KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a 4 ° C. </li><li> Placas de cultura de tecido (6 assim, 12 bem, Corning, UK) </li><li> Frasco de cultura de tecidos (25 cm2 ventiladas, Corning, UK) </li></ol> Manutenção CTEh <ol><li> Rato médio de fibroblastos embrionários condicionado (MEF-CM) (100 mL, R &amp; D Systems, EUA); armazenar a -20 ° C. </li><li> BSA solução (50 mL, Sigma Aldrich, UK); armazenar a 4 ° C. </li><li> Fator de crescimento básico de fibroblastos humanos (100 mg, Peprotech, EUA); armazenar a -20 ° C. </li></ol> HESCs Passaging com colagenase <ol><li> Bem confluentes ou frasco de hESCs. </li><li> Matrigel poços revestidos ou frascos conforme o caso. </li><li> Fosfato salina tamponada (-MgCl 2, CaCl-2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar à temperatura ambiente. </li><li> Colagenase IV (1 g, Gibco, InvitrOgen, UK); armazenar a 4 ° C. </li><li> Rato médio de fibroblastos embrionários condicionado (MEF-CM) (100 mL, R &amp; D Systems, EUA). </li><li> Fator de crescimento básico de fibroblastos humanos (100 mg, Peprotech, EUA). </li></ol> Diferenciação de hESCs a endoderme hepática <ol><li> RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a 4 ° C. </li><li> Suplemento B27 (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a -20 ° C. </li><li> Ativina A (2 mg, Peprotech, EUA); armazenar a -20 ° C. </li><li> Recombinante Wnt3a mouse (2 mg, R &amp; D Systems, EUA); armazenar a -20 ° C. </li><li> KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a 4 ° C. </li><li> KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a -20 ° C. </li><li> Não-aminoácidos essenciais (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a 4 ° C. </li><li> β-mercaptoetanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a 4 ° C. </li><li> DMSO (Sigma Aldrich, UK); armazenar à temperatura ambiente </li><li> Leibovitz L-15 meio de cultura (500 mL, Sigmuma Aldrich, UK); armazenar a 4 ° C. </li><li> Triptose fosfato de caldo de carne (100 mL, Sigma Aldrich, UK); armazenar a 4 ° C. </li><li> Fetal de soro bovino, inactivado pelo calor (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a -20 ° C. </li><li> Armazenar a -20 ° C.; hidrocortisona 21 hemissuccinato (100 mg, Sigma Aldrich, UK) </li><li> Insulina (pâncreas bovino) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); armazenar a -20 ° C. </li><li> L-Glutamina (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); armazenar a -20 ° C. </li><li> O ácido ascórbico (25 g, Sigma Aldrich, UK); armazenar a -20 ° C. </li><li> Humana HGF (10 mg, Peprotech, EUA); armazenar a -20 ° C. </li><li> Recombinante humana Oncostatina M (OSM) (50 mg, R &amp; D Systems, EUA); armazenar a -20 ° C. </li><li> Seringa de unidade orientado filtro de 0,22 mM (Millipore, UK) </li></ol> Caracterização da CTEh endoderma hepática derivada Imunocoloração <ol><li> Tampão fosfato salino (-MgCl 2, CaCl-2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store à temperatura ambiente. </li><li> PBST, PBS feita com 0,1% de Tween 20 (Sigma-Aldrich, UK). </li><li> Paraformaldeído (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) é composto, em PBS, armazenar -20 ° C. </li><li> Glicerol (Sigma-Aldrich, UK), armazenar em temperatura ambiente. </li><li> Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), armazenar em temperatura ambiente. </li><li> Etanol </li><li> Soro (ABD Serotech, UK), armazenar a -20 ° C. </li><li> Anticorpo secundário, fluoróforos Alexa (Molecular Probes, Invitrogen, UK). </li><li> MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, EUA) é composta de Tris HCL e glicerol como por instruções dos fabricantes. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) é adicionado à solução MOWIOL na diluição de 1:1000. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Anticorpos primários </td><td></td><td></td></tr><tr><td> * Antígeno </td><td> Tipo </td><td> Fornecedor </td><td> Diluição </td></tr><tr><td> ALB </td><td> Monoclonal de camundongo </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 05/0100 </td></tr><tr><td> E-caderina </td><td> Monoclonal de camundongo </td><td> Millipore </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> α-fetoproteína </td><td> Monoclonal de camundongo </td><td> Sigma </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> SSEA-4 FITC </td><td> Monoclonal de camundongo </td><td> Biolegend </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Monoclonal de camundongo </td><td> DAKO </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td colspan="2"> Anticorpos secundários </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anti-camundongo conjugado FITC </td><td> Cabra Monoclonal </td><td> Invitrogen </td><td> 1 / 400 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Os anticorpos utilizados para CTEh imunocoloração derivados hepática endoderme, as concentrações utilizadas, a espécie desenvolveu e as empresas que são comprados a partir de. Análise funcional do endoderma hepática e normalização (por mg de proteína) <ol><li> p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits e luminômetro (Promega, EUA). </li><li value="1"> Branco flat bottom 96 placa de ensaio bem (BD Biosciences, UK). </li><li> BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK). </li><li> 96 placa transparente de ensaio bem (IWAKI, UK) </li></ol>

geração robusto de hepatócito-like células de populações humanas células-tronco embrionárias

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Apesar dos progressos na modelagem de toxicidade dos medicamentos humanos, muitos compostos falhar durante os ensaios clínicos devido a efeitos colaterais imprevisíveis. O custo de estudos clínicos são substanciais, por isso, é essencial que mais telas de toxicologia preditiva são desenvolvidos e implantados no início do desenvolvimento de drogas (Greenhough et al 2010). Hepatócitos humanos representam o modelo atual do ouro padrão para avaliar a toxicidade dos medicamentos, mas são um recurso limitado que exibem função variável. Portanto, o uso de linhagens de células imortalizadas e modelos de tecido animal são rotineiramente empregados devido à sua abundância. Enquanto ambas as fontes são informativos, eles são limitados pela função pobres, a variabilidade das espécies e / ou instabilidade na cultura (Dalgetty et al 2009). Células-tronco pluripotentes (PSC) são uma importante fonte alternativa de hepatócitos humanos como células (HLCS) (Medine et al 2010). PSCs são capazes de auto-renovação e diferenciação de todos os tipos de células somáticas encontrada no adulto e, portanto, representamuma fonte potencialmente inesgotável de células diferenciadas. Temos desenvolvido um procedimento que é simples, altamente eficiente, passível de automação e rendimento funcional HLCS humano (Hay et al 2008; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 e Hay et al 2011). Acreditamos que nossa tecnologia irá levar à produção escalonável de HLCS para descoberta de drogas, modelagem de doença, a construção de extra-corpórea dispositivos e, possivelmente, terapias celulares transplante base.

Este artigo incidirá sobre a geração de endoderme hepática humana de populações humanas de células-tronco embrionárias.

Geração robusto de Hepatócito-like Células de populações humanas células-tronco embrionárias

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

O objetivo geral do experimento a seguir é produzir níveis homogêneos de hepatócitos humanos para estudar a biologia do fígado humano in vitro. Isso é iniciado pela condução de células-tronco embrionárias humanas ou ESCs humanas para endoderme definitiva usando estímulos fisiológicos ativos em A e WINT três A.As uma segunda etapa endoderma definitiva é altamente eficientemente conduzida ao endoderma hepático. Em seguida, o endoderma hepático derivado de ESC humano é amadurecido in vitro para produzir hepatócitos humanos funcionais.Os resultados de PCR Western blotting, imunofluorescência, Eliza e metabolismo de drogas indicam que este método deriva hepatócitos de ESCs humanas com uma eficiência de cerca de 90%Com esta técnica, podemos, em teoria, gerar suprimentos inesgotáveis de hepatócitos humanos primários, que exibem níveis apreciáveis de função hepática humana. No futuro, isso beneficiará a previsão precisa da toxicidade do medicamento e fornecerá suporte ao fígado humano. O truque é impulsionar a diferenciação solar e a densidade do núcleo das células humanas.A demonstração visual deste método é crítica, pois a densidade celular central é essencial para gerar uma população celular homogênea. Treinamos mais de 15 indivíduos em quatro locais internacionalmente para realizar essa técnica com sucesso. Comece com uma cultura de células-tronco embrionárias humanas e propague em placas revestidas de matrigel com fibroblastos embrionários de camundongo meio condicionado ORM cm suplementado com FGF básico.É importante caracterizar cuidadosamente as CTEs humanas mantidas antes da diferenciação hepática. Por exemplo, essas células exibem morfologia ESC humana. Eles também expressam os marcadores de células-tronco pluripotentes, OCT quatro e nano em níveis comparáveis à linha ESC humana H seven de controle positivo.Além disso, as CTE humanas são positivas para o SS EEA quatro. Quando as ESCs E humanas atingirem 30 a 60% de fluência de co, substitua o ME CM por um meio de diferenciação recém-preparado. Para iniciar a diferenciação hepática, o meio deve ser substituído a cada 24 horas durante três dias.Após três dias, as células assumem uma aparência triangular à medida que começam a se diferenciar em direção a um fenótipo endodérmico. Mude o meio para a diferenciação SR DMSO. Cultura média por quatro a cinco dias.Substituindo o meio a cada 48 horas. Após esse período de cinco dias, as células começariam a assumir uma aparência poligonal característica das células hepáticas. A diferenciação da ESC humana para o endoderma hepático se reflete em uma série de profundas alterações morfológicas no nono dia.Além disso, a expressão de Octa quatro ao longo do curso de nove dias diminui progressivamente. Em contraste, os transcritos hepáticos de FP e albumina aumentam a partir do sétimo dia. Continuar amadurecendo as células e mantendo o fenótipo hepático em meio final por nove dias com meio fresco a cada 48 horas.Finalmente, monitore as células cultivadas por microscopia de contraste de fase para mudanças morfológicas graduais de uma forma triangular pontiaguda para uma morfologia hepática característica exibindo uma aparência poligonal para avaliar quantitativamente o ensaio da função do endoderme hepático. Para o citocromo P quatro 50 atividade enzimática, especificamente SIP três A quatro ou SIP um A dois. Primeiro dia de incubação 17.Células endodérmicas hepáticas derivadas de ESC humanas com o substrato específico realizando reações em triplicatas. Lembre-se de usar meios de cultura de tecidos como controle negativo incubar a 37 graus Celsius por cinco horas. Recolher os sobrenadantes e medir os níveis relativos da actividade enzimática basal, conforme especificado nas instruções do fabricante.Agora, para cada amostra, calcule a atividade enzimática por miligrama de proteína, conforme determinado por A-B-C-A-S. Imunocoloração de culturas típicas derivadas por este método de maturação in vitro do endoderme hepático. Demonstrar a expressão homogénea de três marcadores hepáticos humanos, albumina a, FP e ein.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como diferenciar eficientemente as células-tronco humanas e de aprendizagem dos hepatócitos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita diariamente com um compromisso de cerca de dois minutos e meio por milhão de células. É muito importante verificar as mudanças morfológicas diariamente durante o processo de diferenciação.

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Biology

Biologia

Este artigo irá focar no desenvolvimento de superfícies de polímeros revestido de longo prazo, estável cultura de células-tronco derivadas de hepatócitos humanos.

Estabilização hepatocelular Fenótipo Usando superfícies sintéticas otimizados

O método aqui apresentado descreve um sistema de diferenciação -Ready escalável e boas práticas de fabrico (BPF) para gerar células de hepatócitos-like humanos a partir de células-tronco pluripotentes. Ele serve como um sistema eficaz e padronizado para gerar células de hepatócitos-like humanos para a pesquisa básica e aplicada fígado humano.

Definido e Geração de Scalable de células de hepatócitos-like de células-tronco pluripotentes humanas

O protocolo aqui apresentado descreve uma plataforma para a identificação de moléculas pequenas para o tratamento de doença hepática. Apresenta-se uma descrição passo a passo detalhando como diferenciar iPSCs em células com características de hepatócitos em placas de 96 poços, para usar as células para a tela para pequenas moléculas com potencial atividade terapêutica.

Usar humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas hepatócitos células para descoberta de drogas

Este protocolo descreve uma abordagem semi-automática para produzir células hepatócito de células-tronco pluripotentes humanas em um formato de 96 placa bem. Este processo é rápida e econômica, permitindo que a produção de qualidade assegurada lotes de hepatócitos células para pesquisa humana básica e aplicada.

Produção semi-automática do hepatócito como células de células-tronco pluripotentes

Este protocolo detalha um monolayer, método soro-livre para gerar eficientemente Hepatocyte-como pilhas das pilhas de haste pluripotentes humanas (hPSCs) em 18 dias. Isto implica seis etapas como hPSCs se diferenciam seqüencialmente em tipos de células intermediárias, como a raia primitiva, endoderma definitivo, foregut posterior e progenitores de broto hepático antes de formar células como hepatócitos.

Diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas em células hepáticas

Este protocolo descreve uma aproximação para produzir hepatospheres das pilhas de haste pluripotentes humanas usando um sistema de cultura definido e um self-assembly da pilha. Este protocolo é reprodutível em um número de linhas de pilha, cost-effective e permite a produção de hepatospheres humanos estáveis para a aplicação biomédica.

Produção livre de soro de Hepatesferas humanas tridimensionais de células-tronco pluripotentes

O objetivo deste artigo é fornecer uma abordagem padronizada para induzir a diferenciação de progenitor hepático humano das células-tronco pluripotentes. O desenvolvimento deste procedimento com formulações de mídia prontas para uso oferece ao usuário um sistema fácil de gerar células hepáticas humanas para pesquisa biomédica e tradução.

Especificação progenitora hepática de células-tronco pluripotentes usando um sistema de diferenciação definido

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em células funcionais semelhantes a hepatócitos (HLCs) complementando continuamente a Activina A e CHIR99021 durante a diferenciação do HESC em endóderme definitivo (DE).

Um método eficiente para indução celular direcionada à hepatocito de células-tronco embrionárias humanas

Aqui apresentamos um método não genético para gerar esferoides hepáticos autólogos humanos usando células mononucleares isoladas do sangue periférico em estado estacionário.

Esferoides do fígado humano do sangue periférico para estudos de doença hepática

Este protocolo descreve a geração de organoides hepáticos endodérmicos rápidos e reprodutíveis (eHEPOs). Com este protocolo, os eHEPOs podem ser produzidos em 2 semanas e expandir a longo prazo (mais de 1 ano) sem perder sua diferenciação e funcionalidade.

Geração de Organoides Hepáticos Endodérmicos Funcionais

Os sistemas de diferenciação de células-tronco pluripotentes (PSC) para células funcionais disponíveis são atualmente impedidos por problemas de variabilidade severa linha a linha e lote a lote. Aqui, usando a diferenciação cardíaca como exemplo principal, apresentamos um protocolo para monitorar e modular de forma inteligente o processo de diferenciação de CEP com base em aprendizado de máquina baseado em imagem.

Uma estratégia de aprendizado de máquina baseada em imagem de células vivas para monitorar a diferenciação de células-tronco pluripotentes

Aprenda a gerar hepatócitos funcionais a partir de células-tronco embrionárias humanas com eficiência de 90%. Este método robusto permite estudar biologia hepática in vitro e testar toxicidade de fármacos.

Geração robusto de Hepatócito-like Células de populações humanas células-tronco embrionárias

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