Geração robusto de Hepatócito-like Células de populações humanas células-tronco embrionárias

O objetivo geral do experimento a seguir é produzir níveis homogêneos de hepatócitos humanos para estudar a biologia do fígado humano in vitro. Isso é iniciado pela condução de células-tronco embrionárias humanas ou ESCs humanas para endoderme definitiva usando estímulos fisiológicos ativos em A e WINT três A.As uma segunda etapa endoderma definitiva é altamente eficientemente conduzida ao endoderma hepático. Em seguida, o endoderma hepático derivado de ESC humano é amadurecido in vitro para produzir hepatócitos humanos funcionais.

Os resultados de PCR Western blotting, imunofluorescência, Eliza e metabolismo de drogas indicam que este método deriva hepatócitos de ESCs humanas com uma eficiência de cerca de 90%Com esta técnica, podemos, em teoria, gerar suprimentos inesgotáveis de hepatócitos humanos primários, que exibem níveis apreciáveis de função hepática humana. No futuro, isso beneficiará a previsão precisa da toxicidade do medicamento e fornecerá suporte ao fígado humano. O truque é impulsionar a diferenciação solar e a densidade do núcleo das células humanas.

A demonstração visual deste método é crítica, pois a densidade celular central é essencial para gerar uma população celular homogênea. Treinamos mais de 15 indivíduos em quatro locais internacionalmente para realizar essa técnica com sucesso. Comece com uma cultura de células-tronco embrionárias humanas e propague em placas revestidas de matrigel com fibroblastos embrionários de camundongo meio condicionado ORM cm suplementado com FGF básico.

É importante caracterizar cuidadosamente as CTEs humanas mantidas antes da diferenciação hepática. Por exemplo, essas células exibem morfologia ESC humana. Eles também expressam os marcadores de células-tronco pluripotentes, OCT quatro e nano em níveis comparáveis à linha ESC humana H seven de controle positivo.

Além disso, as CTE humanas são positivas para o SS EEA quatro. Quando as ESCs E humanas atingirem 30 a 60% de fluência de co, substitua o ME CM por um meio de diferenciação recém-preparado. Para iniciar a diferenciação hepática, o meio deve ser substituído a cada 24 horas durante três dias.

Após três dias, as células assumem uma aparência triangular à medida que começam a se diferenciar em direção a um fenótipo endodérmico. Mude o meio para a diferenciação SR DMSO. Cultura média por quatro a cinco dias.

Substituindo o meio a cada 48 horas. Após esse período de cinco dias, as células começariam a assumir uma aparência poligonal característica das células hepáticas. A diferenciação da ESC humana para o endoderma hepático se reflete em uma série de profundas alterações morfológicas no nono dia.

Além disso, a expressão de Octa quatro ao longo do curso de nove dias diminui progressivamente. Em contraste, os transcritos hepáticos de FP e albumina aumentam a partir do sétimo dia. Continuar amadurecendo as células e mantendo o fenótipo hepático em meio final por nove dias com meio fresco a cada 48 horas.

Finalmente, monitore as células cultivadas por microscopia de contraste de fase para mudanças morfológicas graduais de uma forma triangular pontiaguda para uma morfologia hepática característica exibindo uma aparência poligonal para avaliar quantitativamente o ensaio da função do endoderme hepático. Para o citocromo P quatro 50 atividade enzimática, especificamente SIP três A quatro ou SIP um A dois. Primeiro dia de incubação 17.

Células endodérmicas hepáticas derivadas de ESC humanas com o substrato específico realizando reações em triplicatas. Lembre-se de usar meios de cultura de tecidos como controle negativo incubar a 37 graus Celsius por cinco horas. Recolher os sobrenadantes e medir os níveis relativos da actividade enzimática basal, conforme especificado nas instruções do fabricante.

Agora, para cada amostra, calcule a atividade enzimática por miligrama de proteína, conforme determinado por A-B-C-A-S. Imunocoloração de culturas típicas derivadas por este método de maturação in vitro do endoderme hepático. Demonstrar a expressão homogénea de três marcadores hepáticos humanos, albumina a, FP e ein.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como diferenciar eficientemente as células-tronco humanas e de aprendizagem dos hepatócitos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita diariamente com um compromisso de cerca de dois minutos e meio por milhão de células. É muito importante verificar as mudanças morfológicas diariamente durante o processo de diferenciação.