Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 3:17 min. • April 30th, 2023
Pique o tecido tumoral em pequenos pedaços. Transfira as peças para um tubo com tampão de digestão. As fibras de colágeno ao redor das células são quebradas, degradando a matriz do tecido. Em seguida, pelete os pedaços digeridos e descarte a maior parte do tampão de digestão. Agite o tubo para quebrar o pellet.
A solução agora consiste em aglomerados de células de vários tamanhos. Ressuspenda os aglomerados de células em uma solução de tripsina e um inibidor de ROCK. A tripsina continua quebrando o tumor e o inibidor previne a morte celular. Em intervalos regulares, pipetar a solução para quebrar os aglomerados e dispersar as células. Em seguida, ressuspenda as células em solução de matriz na concentração apropriada.
Coloque gotas da solução em uma placa de cultura para formar cúpulas de matriz. Coloque as placas de cabeça para baixo em uma incubadora e deixe a matriz solidificar completamente. Em seguida, adicione meios de cultura de células e incube, com o lado direito para cima. A matriz fornece um andaime para suportar o crescimento tridimensional do organoide.
Após picar, coloque os pedaços do tumor em um tubo de 15 mililitros de tampão de digestão por 1,5 a 2 horas de digestão a 37 graus Celsius. No final da digestão, sedimentar o tecido digerido por centrifugação e descartar o sobrenadante.
Agite o tubo para soltar o pellet celular. Ressuspenda as células em 1 mililitro de tripsina pré-aquecida suplementada com inibidor de ROCK Y-27632 10 micromolar por 5 minutos a 37 graus Celsius.
No final da incubação, triturar a pasta de tecido cinco vezes com a ponta de pipeta P1000 padrão. Retorne o tubo ao banho-maria para uma incubação e trituração adicionais de 5 minutos.
Para o revestimento da cúpula da matriz, lave as células digeridas em 9 mililitros de meio frio e, em seguida, colete as células por centrifugação. Ressuspenda as células em 1 mililitro de meio fresco para contagem e, após a contagem, colete as células por centrifugação mais uma vez. Dilua as células tumorais no volume apropriado de matriz.
Coloque cuidadosamente 200 microlitros de solução de célula de matriz em cada poço de uma placa de 6 poços aquecida a 55 graus Celsius. Deixe as cúpulas solidificarem em temperatura ambiente por 2 minutos antes de colocar a placa de cabeça para baixo em uma incubadora de 37 graus Celsius por 20 minutos.
Quando as cúpulas estiverem totalmente solidificadas, adicione 2 mililitros de meio organoide de próstata suplementado com andrógeno R1881 e inibidor de ROCK a cada poço. Retorne a placa para a incubadora de cultura de células.