Preparação de organoides a partir de tumores: um modelo de tumor 3D in vitro

Pique o tecido tumoral em pequenos pedaços. Transfira as peças para um tubo com tampão de digestão. As fibras de colágeno ao redor das células são quebradas, degradando a matriz do tecido. Em seguida, pelete os pedaços digeridos e descarte a maior parte do tampão de digestão. Agite o tubo para quebrar o pellet.

A solução agora consiste em aglomerados de células de vários tamanhos. Ressuspenda os aglomerados de células em uma solução de tripsina e um inibidor de ROCK. A tripsina continua quebrando o tumor e o inibidor previne a morte celular. Em intervalos regulares, pipetar a solução para quebrar os aglomerados e dispersar as células. Em seguida, ressuspenda as células em solução de matriz na concentração apropriada.

Coloque gotas da solução em uma placa de cultura para formar cúpulas de matriz. Coloque as placas de cabeça para baixo em uma incubadora e deixe a matriz solidificar completamente. Em seguida, adicione meios de cultura de células e incube, com o lado direito para cima. A matriz fornece um andaime para suportar o crescimento tridimensional do organoide.

Após picar, coloque os pedaços do tumor em um tubo de 15 mililitros de tampão de digestão por 1,5 a 2 horas de digestão a 37 graus Celsius. No final da digestão, sedimentar o tecido digerido por centrifugação e descartar o sobrenadante.

Agite o tubo para soltar o pellet celular. Ressuspenda as células em 1 mililitro de tripsina pré-aquecida suplementada com inibidor de ROCK Y-27632 10 micromolar por 5 minutos a 37 graus Celsius.

No final da incubação, triturar a pasta de tecido cinco vezes com a ponta de pipeta P1000 padrão. Retorne o tubo ao banho-maria para uma incubação e trituração adicionais de 5 minutos.

Para o revestimento da cúpula da matriz, lave as células digeridas em 9 mililitros de meio frio e, em seguida, colete as células por centrifugação. Ressuspenda as células em 1 mililitro de meio fresco para contagem e, após a contagem, colete as células por centrifugação mais uma vez. Dilua as células tumorais no volume apropriado de matriz.

Coloque cuidadosamente 200 microlitros de solução de célula de matriz em cada poço de uma placa de 6 poços aquecida a 55 graus Celsius. Deixe as cúpulas solidificarem em temperatura ambiente por 2 minutos antes de colocar a placa de cabeça para baixo em uma incubadora de 37 graus Celsius por 20 minutos.

Quando as cúpulas estiverem totalmente solidificadas, adicione 2 mililitros de meio organoide de próstata suplementado com andrógeno R1881 e inibidor de ROCK a cada poço. Retorne a placa para a incubadora de cultura de células.

• In vitro tumor models - Methods for studying tumor behavior in lab-controlled conditions.
• PeproTech Noggin - A protein used to regulate cellular processes in tissue culture.
• Tumor model - A method or process used to replicate tumor environment and behavior for scientific studies.
• Cell pellet - Cluster of cells collected at the bottom of a tube after centrifugation.
• ROCK inhibitor organoids - Compounds that prevent cell apoptosis during organoid creation.
• Noggin conditioned media - Media enriched with Noggin protein, used in cellular culture and experiments.
• Cell pellet in tube - Term refers to cells that have been concentrated by centrifugation in a sample tube.

• Introduce In vitro tumor models by defining this as a replicate of tumor behavior (e.g., in vitro tumor models).
• Key Concepts by summarizing principles involved in cell pellet creation (e.g., cell pellet).
• Underlying Mechanisms through visualizing the process of using ROCK inhibitor in organoid creation.
• Connect the process of tumor tissue mincing to the creation of a cell pellet and suspension in a matrix solution.

• What are in vitro tumor models and how to create a cell pellet in lab conditions?
• What role does the PeproTech Noggin play in the tumor model creation?
• How does the ROCK inhibitor assist in the creation of organoids?

• Practical Applications - Tumor models help study cancer growth and potential cures (e.g., in vitro tumor models).
• Industry Impact - Lab studies benefit the healthcare industry and the field of oncology (e.g., ROCK inhibitor organoids).
• Societal Importance - The research contributes to advancements in cancer treatment options (e.g., Noggin conditioned media).
• Link to Scientific Advancements - Understanding tumor behavior facilitates innovative treatment approaches.