Sistema de Cultura Proximal: Uma Técnica de Cultura In Vitro para Estudar a Sinalização Parácrina entre Células

Na sinalização parácrina, as células produzem e secretam moléculas de sinalização que induzem respostas nas células vizinhas. Para imitar a sinalização parácrina, comece preparando suspensões unicelulares de células cancerígenas de ovário e células mesoteliais em seu meio apropriado.

Em seguida, pegue uma inserção membranosa porosa invertida em uma placa de cultura estéril. Pipete a suspensão de células cancerígenas na superfície inferior da membrana de inserção para formar uma cúpula líquida. Incube para permitir que as células se estabeleçam e se fixem à membrana.

Inverta o inserto para drenar a mídia. Transfira o inserto para uma placa de cultura fresca contendo meio de crescimento para nutrir as células cancerígenas aderidas à superfície inferior da membrana. Agora, adicione a suspensão de células mesoteliais no poço de inserção. Incubar para permitir que as células adiram ao lado oposto da membrana, negando qualquer contato direto entre os dois tipos de células.

Durante a cultura, ambos os tipos de células secretam fatores de sinalização. Essas moléculas se difundem através da membrana porosa em direção às células vizinhas. Eles se ligam a receptores celulares específicos e induzem cascatas de sinalização complexas em ambos os tipos de células.

Comece destacando as células cancerígenas do ovário de uma mistura confluente de 80% com 1 mililitro de tripsina a 0,25% por 40 a 60 segundos, seguido de neutralização da reação com 6 mililitros de meio de crescimento completo. Colete as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em 5 mililitros de meio de crescimento completo fresco.

Após a contagem, dilua as células para 100.000 células de câncer de ovário por mililitro de concentração completa do meio de crescimento e coloque três inserções de cultura de células de membrana de policarbonato tratadas com cultura de tecidos de poros invertidos de 0,4 micrômetro por condição experimental em uma placa de cultura de tecidos estéreis de tamanho apropriado. Rotule as inserções de acordo com a condição experimental e pipete cuidadosamente as células cancerígenas na parte inferior de cada inserção em círculos concêntricos, começando do meio da membrana e movendo-se para fora, para formar uma cúpula de 800 microlitros.

Seja extremamente cuidadoso ao semear as células na superfície inferior do inserto para que a cúpula das células contendo o meio não escorra das bordas do inserto durante a incubação.

Quando todas as inserções tiverem sido semeadas, cubra o prato e coloque-as cuidadosamente na incubadora de cultura de células. Após cerca de 4 horas, destacar o HPMC com 2 mililitros de tripsina a 0,25% por um a dois minutos, seguido de neutralização da reação com 12 mililitros de meio de crescimento completo.

Colete o HPMC por centrifugação e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio de crescimento completo para contagem. Dilua as células a 300.000 HPMC por mililitro de meio de crescimento completo e adicione 2,5 mililitros de meio de crescimento completo fresco a cada poço de uma placa de cultura de 6 poços.

Usando uma pinça estéril, coloque cada inserto com o lado direito para cima em cada poço da placa de 6 poços para que as superfícies inferiores das células cancerígenas do ovário fiquem imersas no meio. Em seguida, semeie 1,5 mililitros de HPMC no poço de cada inserto e coloque a placa na incubadora de cultura de células por 72 horas.

• Paracrine Signaling - Cellular communication through secreted molecules affecting neighboring cells.
• Mesothelial Surface - The membrane where the mesothelial cells adhere and function.
• Culture System - Set-up where cells are grown under controlled conditions, often in vitro.
• Corning 10-013-CV - Specific type of culture dish used for cell adhesion and growth experiments.
• In Vitro Cell Culture Techniques - Methods used to cultivate cells in controlled environments outside of the living organism.

• Introduce Paracrine Signaling – Paracrine signaling is the process by which cells communicate and influence the behavior of neighboring cells via secreted molecules (e.g., paracrine).
• Key Concepts - We can simulate this biological process in an in vitro cell culture system using human mesothelial cells and cancer cells (e.g., culture system).
• Underlying Mechanisms - Both cell types secret signaling factors which bind to receptors and trigger complex responses (e.g., mesothelial surface).
• Connect to Experiment - To study this, cells are cultivated on either side of a porous membrane in a culture dish (e.g., corning 10-013-CV).

• What is paracrine signaling and how does it work in an in vitro culture system?
• How are mesothelial and cancer cells cultured for this study?
• What are the key concepts and mechanisms underlying paracrine signaling?

• Practical Applications - Understanding paracrine signaling could improve diagnosis and treatment of diseases like cancer (e.g., in vitro cell culture techniques).
• Industry Impact - The knowledge acquired is beneficial for the medical and pharmaceutical sectors (e.g., culture system).
• Societal Importance - The broader implications extend to improving patient outcomes and quality of care (e.g., mesothelial surface).
• Link to Scientific Advancements - The use of in vitro cultivation techniques continues to advance our understanding of cell communication (e.g., corning 10-013-CV).