Modelagem de metástase de câncer de ovário no revestimento da cavidade peritoneal: um método para estabelecer um modelo 3D in vitro do revestimento peritoneal

O peritônio, ou a membrana que reveste a cavidade abdominal, constitui células mesoteliais peritoneais sustentadas sobre uma camada de tecido conjuntivo fibrovascular. As células cancerígenas do ovário em metástase aderem a esse revestimento peritoneal e proliferam em crescimentos cancerígenos.

Para modelar a metástase do câncer de ovário, comece pegando fibroblastos humanos em um tubo cônico e misturando-os com colágeno - uma proteína da matriz extracelular. Coloque a suspensão em um prato de cultura. Incubar para facilitar a solidificação da matriz de colágeno para incorporar os fibroblastos e imitar o tecido conjuntivo do peritônio.

Em seguida, adicione uma suspensão de células mesoteliais sobre a camada de fibroblasto-colágeno. Incube a placa para permitir que as células mesoteliais adiram e formem uma monocamada na superfície da camada de fibroblasto-colágeno. Essa cultura organotípica 3D agora imita a composição e a arquitetura de um revestimento peritoneal in vivo.

Finalmente, semeie esta cultura organotípica com células de câncer de ovário e incube pela duração desejada. As células cancerígenas do ovário liberam certas moléculas de sinalização que alteram a camada mesotelial, aumentando a adesão e invasão das células cancerígenas, imitando condições metastáticas in vivo.

Para liberar os fibroblastos normais do omento da cultura, lave o frasco de cultura com 10 mililitros de PBS seguidos de 3 mililitros de tripsina por no máximo 5 minutos. Quando as células se desprenderem, neutralizar a tripsina com pelo menos três vezes o volume do meio de crescimento total e transferir as células para um tubo cónico de 50 mililitros. Gire as células e ressuspenda o pellet em 5 mililitros de meio de crescimento total. Em seguida, conte as células e dilua-as para 2 a 4 vezes 10 elevado ao terceiro fibroblasto por 100 microlitros de concentração total do meio de crescimento.

Em seguida, adicione 0,5 microgramas por 100 microlitros de colágeno I de cauda de rato às células e coloque 100 microlitros de células por poço em uma placa preta de fundo transparente de 96 poços. Em seguida, transfira a placa para uma incubadora de cultura de células por pelo menos 4 horas ou até que as células adiram à superfície da placa. Enquanto os fibroblastos normais do omento estão se acomodando, retire o HPMC de seus frascos de cultura e dilua essas células para 1 a 2 vezes 10 elevado ao quarto HPMC por 50 microlitros de meio de crescimento total.

Em seguida, adicione 50 microlitros de HPMC por poço aos fibroblastos de omento normais anexados e retorne a placa à incubadora de cultura de células por pelo menos 18 horas antes do uso experimental. No dia seguinte, semeie as co-culturas organotípicas 3D com células de câncer de ovário que expressam GFP a partir de uma cultura confluente de 80% a 90% na diluição apropriada para o ensaio a jusante desejado.