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As células mesoteliais primárias humanas, ou HPMCs, revestem muitos órgãos viscerais, como o omento ou a camada de tecido adiposo presente na cavidade peritoneal.
Para isolar as células mesoteliais, comece imergindo uma amostra de omento humano em um tampão adequado para remover o excesso de glóbulos vermelhos ou hemácias. Em seguida, coloque o omento em um prato de vidro e pique-o em pedaços. Isso dissocia o tecido, liberando HPMCs junto com as hemácias contaminantes.
Transfira as peças para um tubo cônico e deixe-as paradas pelo tempo desejado. O tecido picado rico em gordura de baixa densidade sobe para o topo, enquanto os componentes celulares densos se depositam na parte inferior. Em seguida, aspire o líquido no fundo, contendo HPMCs e RBCs, em um tubo novo.
Centrifugue para coletar as células. Remova o sobrenadante contendo buffer. Ressuspenda o pellet em um meio de crescimento mesotelial e incube pela duração desejada. A mídia facilita o crescimento seletivo de HPMCs sobre hemácias.
Observe as células usando um microscópio óptico para confirmar o crescimento de células mesoteliais humanas em forma cuboidal.
Após a aquisição de uma amostra cirúrgica de omento humano, mergulhe imediatamente a amostra em PBS em temperatura ambiente. Dentro de 2 horas após a imersão, transfira o omento para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 20 mililitros de PBS fresco. Transfira a lavagem restante do PBS contendo as células mesoteliais humanas primárias ou HPMC e glóbulos vermelhos para um novo tubo cônico de 50 mililitros e gire as células.
Em seguida, despeje o conteúdo do tubo em uma placa de cultura estéril de 10 centímetros e use dois bisturis para picar o tecido em pedaços de 5 milímetros cúbicos. Para isolar as células mesoteliais humanas primárias ou HPMC, transfira os pedaços de omento para um tubo cônico de 50 mililitros e aguarde 1 minuto para que os pedaços sólidos flutuem até o topo. O HPMC se depositará no fundo do tubo com os glóbulos vermelhos.
Use uma pipeta para transferir a lavagem de PBS contendo células mesoteliais e glóbulos vermelhos para o tubo que contém as células peletizadas e gire as células. Em seguida, adicione 20 mililitros de PBS fresco ao omento e colete o HPMC e RBC contendo PBS mais três vezes, conforme demonstrado nas células peletizadas originais.
Após a centrifugação final, coloque as células em um frasco de 75 centímetros quadrados em 15 mililitros de meio de crescimento total. Para isolar HPMC adicional da amostra de omento, agite o tecido sólido restante em 20 mililitros de PBS a 200 RPM e 37 graus Celsius. Após 10 minutos, deixe a amostra descansar por 1 minuto para permitir que o tecido sólido suba até o topo do tubo.
Em seguida, colete o HPMC e as hemácias do fundo do tubo, conforme demonstrado. Agora, gire as células da lavagem secundária e coloque-as em um frasco separado de 75 centímetros quadrados em 15 mililitros de meio de crescimento total. Para isolar qualquer HPMC restante, agite o tecido por mais 10 minutos, desta vez em uma mistura de PBS e 10 mililitros de tripsina-EDTA, e coloque esses HPMC e RBC em um frasco de 75 centímetros quadrados.
Em seguida, incube as culturas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em um ambiente umidificado. Alimentar as células plaqueadas com 15 mililitros de meio de crescimento completo fresco nos dias 3 e 5 sem remover o meio gasto. O HPMC pode ser identificado por sua forma cuboidal e sua expressão de citoqueratina-8 e vimentina.