JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 4:34 min • April 30th, 2023
Durante a metástase do câncer de ovário, as células malignas se desprendem do local do tumor primário e começam a circular dentro da cavidade peritoneal. Essas células podem então formar aglomerados ou esferóides que aderem à monocamada de células mesoteliais que reveste a cavidade peritoneal. À medida que o tumor cresce, ele limpa as células mesoteliais subjacentes para facilitar a invasão.
Para modelar a depuração mesotelial, comece semeando células mesoteliais que expressam proteína fluorescente verde ou GFP em uma placa de cultura com fundo de vidro revestida com fibronectina. O revestimento de fibronectina fornece uma matriz que promove a fixação celular. Incube o prato para permitir que as células mesoteliais se espalhem e formem uma monocamada.
Em seguida, transfira uma suspensão de esferóides de células cancerígenas de ovário expressando proteína fluorescente vermelha para a monocamada mesotelial. Visualize a cultura por um período prolongado usando microscopia de fluorescência de lapso de tempo. Os esferóides vermelho-fluorescentes se estabelecerão e se ligarão à monocamada mesotelial verde-fluorescente.
As células cancerígenas exercem força sobre as células mesoteliais, interrompendo as junções celulares e alterando a integridade da camada mesotelial. A força também desloca as células mesoteliais subjacentes, gerando um buraco. Escolha uma configuração de filtro GFP apropriada para visualizar o orifício resultante como um espaço preto na imagem. Meça o espaço para quantificar a extensão da depuração mesotelial.
Para iniciar este procedimento, pré-cubra os poços de uma placa MatTek com fundo de vidro de 6 poços com fibronectina. Adicione 2 mililitros de solução de fibronectina / PBS a cada poço do prato e incube em temperatura ambiente por 30 minutos. As células mesoteliais que expressam proteínas fluorescentes verdes, para formar uma monocamada de células mesoteliais, são cultivadas em meio base a 10%. Tripsinize uma placa de células mesoteliais e gire em uma centrífuga de mesa a 900 RPM por três minutos.
Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em meio base a 10%. Ajuste para a concentração desejada com 10% de meio base. Quando a incubação de fibronectina de 30 minutos da placa MatTek estiver concluída, lave os poços com 2 mililitros de PBS. Aspire o PBS e coloque 6 vezes 10 até as quintas células mesoteliais por poço em cada poço do prato MatTek de 6 poços. Incube a placa MatTek em uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius durante a noite para permitir que as células mesoteliais se fixem à placa e formem uma monocamada.
Use uma pipeta para coletar os esferoides do câncer de ovário da placa revestida com poli-HEMA de 96 poços. Aspire o meio de um poço da placa MatTek de 6 poços contendo uma monocamada de células mesoteliais. Lave uma vez com 2 mililitros de PBS. Adicione todos os esferóides da placa de 96 poços a um poço da placa MatTek. Isso é aproximadamente três vezes o número de esferóides que serão fotografados para contabilizar os esferóides que pousam na parte do prato que não pode ser fotografada.
Como queremos criar imagens de apenas um esferóide por campo de visão, a agregação dos esferóides deve ser evitada. Balance o prato suavemente de um lado para o outro para distribuir os esferóides uniformemente pela monocamada antes de se prenderem.
Coloque a antena MatTek no palco de um microscópio de fluorescência de campo amplo invertido capaz de realizar imagens de lapso de tempo por pelo menos oito horas. Use um estágio motorizado para criar imagens de várias posições no prato, com vários eventos de intercalação esferoide, em um único experimento. Os esferóides das células cancerígenas do ovário se depositam no fundo do prato e se ligam à monocamada das células mesoteliais. Colete GFP, RFP e imagens de fase de mais de 20 interações esferoides/monocamadas a cada dez minutos durante oito horas.
Este estudo investiga a interação entre esferoides de câncer de ovário e células mesoteliais durante a metástase. A metodologia envolve a obtenção de imagens dessas interações para compreender os mecanismos de eliminação mesotelial.
A avaliação quantitativa da invasão de esferoides de câncer de ovário em monocamadas de células mesoteliais aborda uma etapa crítica inicial na progressão metastática, fornecendo diretamente informações para a validação de alvos e redução de riscos mecanicistas em pipelines de oncologia. Este ensaio permite a medição de alto conteúdo e reprodutível de interações célula-célula relevantes para a disseminação metastática, apoiando a confiança preditiva no ponto de transição entre descoberta e pré-clínico. A integração de saídas de imagem quantitativa fortalece a triagem e priorização de portfólios para estratégias terapêuticas anti-metastáticas.
Este ensaio de clareamento mesotelial insere-se no continuum de descoberta a pré-clínico, permitindo testes de hipóteses, validação de alvos e triagem inicial de compostos para inibição metastática.
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Última atualização: 29 agosto 2026