Conversão de bissulfito de DNA genômico: um método para estudar a metilação do DNA em amostras de DNA genômico de tecido de câncer gastrointestinal

A metilação do DNA envolve a adição de grupo metil aos resíduos de citosina do DNA para formar metilcitosina, causando alteração do DNA e regulação da expressão gênica.

Para estudar a metilação do DNA, comece tomando extrato bruto de DNA de células cancerígenas. Adicionar um tampão de diluição e incubar à temperatura ambiente. O tampão dilui a mistura e desnatura o DNA de fita dupla em DNA de fita simples, favorecendo a acessibilidade das bases para reações subsequentes.

Adicione um reagente de conversão e incube no escuro. O bissulfito de sódio no reagente desencadeia a sulfonação e subsequente desaminação de resíduos de citosina não metilada, resultando na formação de uracila-sulfonato. No entanto, os resíduos de citosina metilada permanecem inalterados.

Em seguida, complemente o DNA com um tampão de ligação e transfira-o para uma coluna de filtro de rotação pré-montada. O tampão ajuda o DNA a se ligar ao filtro.

Centrifugue para remover o tampão e a mistura de reagentes de bissulfito do DNA preso na coluna. Descarte o fluxo. Adicione um tampão de dessulfonação alcalina ao DNA. O tampão auxilia na remoção do grupo sulfito do uracil-sulfonato para formar uracila.

Centrifugue para remover o tampão gasto. Agora, adicione um tampão de eluição à coluna para eluir o DNA convertido. Realize PCR para amplificar o DNA. Todos os resíduos de uracila convertidos se amplificam como timinas, enquanto os resíduos de citosina metilada se amplificam como citosinas.

Sequencie os resíduos de citosina do DNA amplificado para gerar um perfil de metilação da amostra.

Realize o tratamento com bissulfito em 45 microlitros do tecido digerido usando um kit de conversão de bissulfito de acordo com as instruções do fabricante. Adicione 5 microlitros de tampão de diluição à amostra e incube-a a 37 graus Celsius por 15 minutos. Enquanto isso, prepare o reagente de conversão de bissulfito adicionando 750 microlitros de água destilada e 210 microlitros de tampão de diluição a um tubo de reagente de conversão de TC. Misture os tubos por vórtice por 10 minutos. Em seguida, adicione 100 microlitros do reagente de conversão CT preparado a cada amostra e misture por inversão.

Incube as amostras no escuro a 50 graus Celsius por 12 a 16 horas. Após a incubação, coloque as amostras no gelo por 10 minutos. Adicione 400 microlitros de tampão de ligação e misture cada amostra pipetando para cima e para baixo. Carregue cada amostra em uma coluna de centrifugação e coloque a coluna em um tubo de coleta de 2 mililitros. Centrifugue as amostras em velocidade máxima por 1 minuto e descarte o fluxo. Adicione 200 microlitros de tampão de lavagem a cada coluna e gire em velocidade máxima por 1 minuto, depois descarte o fluxo.

Adicione 200 microlitros de tampão de dessulfonação a cada coluna e deixe as colunas em temperatura ambiente por 15 minutos. Após a incubação, gire as colunas em velocidade máxima por 1 minuto e descarte o fluxo. Lave a coluna duas vezes com 200 microlitros de tampão de lavagem, centrifugando por 1 minuto em velocidade máxima após cada lavagem.

Adicione 46 microlitros de água destilada a cada coluna e coloque-a em um novo tubo estéril de polipropileno descartável de 1,5 mililitro. Gire os tubos por 2 minutos para eluir o DNA e descarte a coluna. O DNA agora está pronto para a análise. Use o DNA modificado com bissulfito como modelo para PCR quantitativo específico de metilação para avaliar a metilação da região promotora em cada análise gênica. Combine os reagentes conforme descrito no manuscrito do texto e use um instrumento de PCR em tempo real de 96 poços para executar o protocolo de ciclagem térmica.