Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 4:24 min. • April 30th, 2023
A vitrificação, uma técnica de criopreservação ultrarrápida, permite que células e tecidos vivos sejam resfriados e armazenados em temperaturas extremamente baixas por períodos muito longos.
Para vitrificar um tecido tumoral recém-colhido, primeiro coloque o tecido em uma placa de cultura. Extirpar quaisquer regiões necróticas, regiões contendo gordura ou coágulos sanguíneos do tumor. Lave o lenço para remover quaisquer vestígios de sangue.
Corte o tecido em fatias de espessura apropriada. Agora, transfira as fatias para um tubo contendo uma solução de vitrificação constituindo DMSO, ou dimetilsulfóxido, e sacarose. Esses constituintes atuam como crioprotetores para proteger as células contra danos causados pelo congelamento.
Incubar a baixa temperatura. O DMSO, um crioprotetor que permeia as células, difunde-se através da membrana celular e substitui a água nas células para evitar a formação de cristais de gelo intracelulares. Ao mesmo tempo, a sacarose, um crioprotetor não permeante, atua extracelularmente, facilitando a desidratação celular e reduzindo a formação de cristais de gelo intracelulares para mitigar o risco de morte celular.
Coloque as fatias de tumor equilibradas em um suporte de tecido. Em seguida, transfira este conjunto para nitrogênio líquido para congelar a menos 196 graus Celsius. Esse resfriamento rápido resulta na vitrificação da amostra que solidifica o tecido em um estado vítreo e amorfo, enquanto a alta concentração de crioprotetores evita a formação de cristais de gelo e danos às células.
O tecido vitrificado permanece em um estado de atividade metabólica suspensa.
Depois de sacrificar os camundongos, use uma pinça e uma tesoura estéreis para isolar lentamente o tumor dos camundongos. Lave os tecidos tumorais em DPBS e um prato de 10 centímetros. Use fórceps e tesouras para dissecar e remover áreas necróticas, tecido adiposo, coágulos sanguíneos e tecido conjuntivo.
Em seguida, use um molde para cortar os tecidos tumorais com uma espessura máxima de 1 milímetro. Lave as fatias do tumor com DPBS em um prato de 10 centímetros. Para iniciar o processo de vitrificação, use uma pinça para transferir as fatias para o tubo V1 e incubar a 4 graus Celsius por 4 minutos. Role e inverta o tubo brevemente e incube a 4 graus Celsius por mais 4 minutos.
Em seguida, despeje a solução V1 e as fatias em um prato de 10 centímetros e use uma pinça para transferir as fatias para o tubo V2. Incube a 4 graus Celsius por 4 minutos. Role e inverta o tubo brevemente e incube a 4 graus Celsius por mais 4 minutos. Depois disso, despeje a solução V2 e as fatias em um prato de 10 centímetros.
Transfira as fatias para o tubo V3 e incube a 4 graus Celsius por 5 minutos. Role e inverta o tubo brevemente e incube a 4 graus Celsius por mais 5 minutos.
Certifique-se de que todas as fatias afundem no fundo do tubo. Se várias fatias permanecerem flutuando, role e inverta o tubo brevemente e incube a 4 graus Celsius até que todas as fatias afundem completamente. Em seguida, despeje a solução V3 e as fatias em um prato de 10 centímetros. Corte os porta-lenços no comprimento adequado e coloque-os em gaze estéril. Transfira as fatias para os suportes. Enrole os suportes com gaze.
Usando uma pinça, coloque os suportes em nitrogênio líquido e deixe-os incubar por 5 minutos. Depois disso, rotule os frascos criogênicos com as informações do tecido. Transfira os suportes com fatias de tecido para os frascos, que serão armazenados em nitrogênio líquido.