Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 3:15 min. • April 30th, 2023
Sob condições patológicas como câncer, os neutrófilos ativados liberam armadilhas extracelulares de neutrófilos ou NETs - uma malha de DNA extracelular com enzimas associadas e proteínas antimicrobianas - que aprisionam as células cancerígenas circulantes.
Para visualizar a interação adesiva entre NETs e células tumorais in vitro, comece cultivando neutrófilos de baixa densidade, um subtipo de neutrófilos, em uma placa de cultura revestida com polímero que promove a fixação celular. Incube por algumas horas para estimular os neutrófilos a formar NETs semelhantes a teias.
Adicione uma suspensão de células cancerígenas marcadas com fluoresceína vermelha à cultura de neutrófilos. Incube as células cancerígenas com TNEs por um breve período para facilitar a interação célula cancerígena-NET. O NET-DNA atua como um fator quimiotático que atrai células cancerígenas e promove sua adesão aos TNEs.
Remova o meio gasto. Lave suavemente a cultura com um meio fresco adequado para remover bem quaisquer células tumorais soltas da cultura.
Agora, adicione uma mancha nuclear fluorescente verde impermeável à membrana para colorir os TNEs extracelulares seletivamente. Observar a cultura ao microscópio de fluorescência. As armadilhas extracelulares de neutrófilos aparecem como estruturas verdes semelhantes a cordas que formam uma malha à qual as células tumorais vermelhas estão ligadas.
Ressuspenda os neutrófilos isolados de baixa densidade em 5 vezes 10 a sexta células por mililitro de meio RPMI 1640 suplementado com concentração de FBS e semeie 1 mililitro de neutrófilos por poço em uma placa revestida de poli-L-lisina de 6 poços. Após 2 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, corar as células em cada poço com um corante nuclear e cromossômico fluorescente impermeável à membrana apropriada de acordo com as instruções do fabricante e observar imediatamente a morfologia dos TNEs por microscopia de fluorescência.
Para avaliar a adesão das células tumorais aos TNEs, ressuspenda as células tumorais gástricas coradas com um corante fluorescente contrastante a 1 vezes 10 elevado ao sexto por mililitro de RPMI 1640 suplementado com 0,1% de concentração de albumina sérica bovina e adicione 1 mililitro de células tumorais a cada poço das culturas de neutrófilos de baixa densidade. Após 5 minutos a 37 graus Celsius, remova o sobrenadante de cada poço e lave suavemente as células duas vezes com 2 mililitros de meio RPMI 1640 pré-aquecido suplementado com BSA por lavagem.
Uma incubação de 5 minutos é longa o suficiente para detectar a ligação específica do NET. Adicione o meio quente ao lado de cada poço lentamente, gire suavemente a placa e remova o sobrenadante com um aspirador.
Os NETs e as células tumorais anexadas podem então ser observados por microscopia de fluorescência.