Microscopia de fluorescência de armadilhas extracelulares de neutrófilos ou NETs: uma técnica para observar a interação adesiva entre células cancerígenas e NETs
JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 3:15 min • April 30th, 2023
Sob condições patológicas como câncer, os neutrófilos ativados liberam armadilhas extracelulares de neutrófilos ou NETs - uma malha de DNA extracelular com enzimas associadas e proteínas antimicrobianas - que aprisionam as células cancerígenas circulantes.
Para visualizar a interação adesiva entre NETs e células tumorais in vitro, comece cultivando neutrófilos de baixa densidade, um subtipo de neutrófilos, em uma placa de cultura revestida com polímero que promove a fixação celular. Incube por algumas horas para estimular os neutrófilos a formar NETs semelhantes a teias.
Adicione uma suspensão de células cancerígenas marcadas com fluoresceína vermelha à cultura de neutrófilos. Incube as células cancerígenas com TNEs por um breve período para facilitar a interação célula cancerígena-NET. O NET-DNA atua como um fator quimiotático que atrai células cancerígenas e promove sua adesão aos TNEs.
Remova o meio gasto. Lave suavemente a cultura com um meio fresco adequado para remover bem quaisquer células tumorais soltas da cultura.
Agora, adicione uma mancha nuclear fluorescente verde impermeável à membrana para colorir os TNEs extracelulares seletivamente. Observar a cultura ao microscópio de fluorescência. As armadilhas extracelulares de neutrófilos aparecem como estruturas verdes semelhantes a cordas que formam uma malha à qual as células tumorais vermelhas estão ligadas.
Ressuspenda os neutrófilos isolados de baixa densidade em 5 vezes 10 a sexta células por mililitro de meio RPMI 1640 suplementado com concentração de FBS e semeie 1 mililitro de neutrófilos por poço em uma placa revestida de poli-L-lisina de 6 poços. Após 2 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, corar as células em cada poço com um corante nuclear e cromossômico fluorescente impermeável à membrana apropriada de acordo com as instruções do fabricante e observar imediatamente a morfologia dos TNEs por microscopia de fluorescência.
Para avaliar a adesão das células tumorais aos TNEs, ressuspenda as células tumorais gástricas coradas com um corante fluorescente contrastante a 1 vezes 10 elevado ao sexto por mililitro de RPMI 1640 suplementado com 0,1% de concentração de albumina sérica bovina e adicione 1 mililitro de células tumorais a cada poço das culturas de neutrófilos de baixa densidade. Após 5 minutos a 37 graus Celsius, remova o sobrenadante de cada poço e lave suavemente as células duas vezes com 2 mililitros de meio RPMI 1640 pré-aquecido suplementado com BSA por lavagem.
Uma incubação de 5 minutos é longa o suficiente para detectar a ligação específica do NET. Adicione o meio quente ao lado de cada poço lentamente, gire suavemente a placa e remova o sobrenadante com um aspirador.
Os NETs e as células tumorais anexadas podem então ser observados por microscopia de fluorescência.
Visão Geral
Este estudo investiga a interação entre armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) e células cancerígenas. Descreve um método in vitro para visualizar essa interação, destacando o papel das NETs na adesão de células cancerígenas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Oncologia
Antecedentes
- Os neutrófilos podem liberar NETs em condições patológicas.
- As NETs são compostas por DNA extracelular e proteínas antimicrobianas.
- As NETs podem desempenhar um papel no aprisionamento de células cancerígenas circulantes.
- A interação entre as NETs e as células tumorais é crucial para a compreensão da progressão do câncer.
Objetivo do Estudo
- Visualizar a interação entre NETs e células cancerígenas in vitro.
- Avaliar as propriedades adesivas das NETs em relação às células tumorais.
- Compreender as implicações das NETs na biologia do câncer.
Métodos Utilizados
- Cultive neutrófilos de baixa densidade em uma placa revestida com polímero.
- Incube os neutrófilos para estimular a formação de NETs.
- Adicione células cancerígenas marcadas com fluoresceína vermelha ao cultivo de neutrófilos.
- Utilize microscopia de fluorescência para observar as interações entre NETs e células tumorais.
Resultados Principais
- As NETs foram visualizadas como estruturas verdes semelhantes a filamentos.
- Células tumorais vermelhas foram observadas aderidas às NETs.
- O DNA das NETs atuou como um fator quimiotático para a adesão de células cancerígenas.
- A microscopia de fluorescência confirmou a ligação das células tumorais às NETs.
Conclusões
- As NETs facilitam a adesão de células cancerígenas in vitro.
- Essa interação pode contribuir para a metástase do câncer.
- São necessários mais estudos para explorar as implicações terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) e suas interações adesivas com células cancerígenas aborda um desafio crítico na compreensão da dinâmica do microambiente tumoral. Esta técnica de microscopia de fluorescência permite a observação direta de interações célula-matriz relevantes para a progressão metastática e a validação de alvos. O método apoia a redução de riscos mecanicistas na interface entre imunologia e oncologia, orientando decisões de portfólio em estágios iniciais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta de mecanismos adesivos mediados por ETN na biologia celular do câncer.
- Apoia a validação funcional de alvos mediante a visualização de interações célula-matriz in vitro.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas em hipóteses de imuno-oncologia envolvendo atividade de neutrófilos.
- Fornece evidências para priorização de alvos associados à adesão celular tumoral e metástase.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Estabelece um sistema in vitro reprodutível para quantificar a adesão de células cancerígenas a NETs.
- Permite a padronização de leituras baseadas em fluorescência para fluxos de trabalho de triagem downstream.
- Apoia o desenvolvimento de ensaios para compostos que modulam a formação de NETs ou a ligação de células tumorais.
- Oferece uma plataforma para avaliar moléculas candidatas em um contexto controlado e quantitativo.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Alinha descobertas in vitro com mecanismos relevantes para a doença implicados na metástase.
- Apoia a continuidade do descobrimento à validação pré-clínica de estratégias anti-metastáticas.
- Permite o avanço ajustado ao risco de agentes imunomoduladores que visam NETs.
- Facilita a identificação de biomarcadores translacionais associados às interações entre NETs e células cancerígenas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de microscopia de fluorescência integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir testes de hipóteses sobre interações imune-tumorais e apoiar a identificação de compostos líderes para agentes anti-metastáticos.
- Biologia da Descoberta: Fornece visualização direta da adesão entre NETs e células cancerígenas, elucidando mecanismos mediados pelo sistema imunológico.
- Triagem: Gera resultados quantitativos e reprodutíveis para avaliação de compostos que visam NETs ou vias de adesão.
- Análises: Permite a mensuração da adesão celular e da formação de NETs, possibilitando análises comparativas entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta insights mecanicistas obtidos in vitro com modelos pré-clínicos de metástase, quando apoiada por estudos adicionais.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma padronizada de ensaio adaptável a diversos tipos de células cancerígenas e moduladores imunológicos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos em imuno-oncologia e na desvinculação mecanicista de riscos.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e escalabilidade de ensaios de adesão celular utilizando microscopia de fluorescência.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir ou não em programas terapêuticos imunomoduladores e anti-metastáticos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos que visam interações entre tumor e sistema imunológico.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em microscopia de fluorescência e técnicas de cultivo celular.
- Necessita de acesso a materiais de cultivo revestidos com polímero e corantes fluorescentes validados.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de coloração e de imagem.
- Adaptável a diferentes linhagens de células cancerosas e fontes de neutrófilos mediante otimização do protocolo.
- Limitado à observação in vitro; a relevância translacional depende de validação adicional.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
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Última atualização: 22 agosto 2026