JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 3:05 min • April 30th, 2023
Durante condições patológicas como o câncer, os neutrófilos ativados liberam armadilhas extracelulares de neutrófilos ou NETs - uma rede de fibras de DNA extracelular associadas a histonas e enzimas proteolíticas. Essas estruturas aprisionam as células cancerígenas e desempenham um papel fundamental na metástase do câncer.
Para estudar o comportamento pós-adesão de células cancerígenas aprisionadas em TNEs in vitro, primeiro, cultive neutrófilos de baixa densidade - uma subpopulação de neutrófilos - em uma placa de cultura revestida com polímero que facilita a fixação celular. Incubar para ativar os neutrófilos para liberar NETs semelhantes a malhas.
Em seguida, adicione um corante nuclear fluorescente verde impermeável à membrana para corar as fibras de DNA em NETs especificamente. Remova o meio gasto. Adicione uma suspensão de células cancerígenas à cultura de neutrófilos.
Incube a cultura por um curto período para facilitar a interação célula cancerígena-NET. O componente de DNA dos TNEs funciona como um fator quimiotático que estimula a migração de células cancerígenas e auxilia em sua adesão aos TNEs.
Remova o meio gasto. Enxágue suavemente a cultura com meios frescos apropriados para remover quaisquer células cancerígenas não ligadas do prato de cultura. Reabasteça com um novo meio contendo soro.
Visualize a cultura por um período prolongado usando microscopia de vídeo com lapso de tempo para analisar os eventos interativos entre NETs e células cancerígenas. Com o tempo, os TNEs fornecem um microambiente adequado que facilita a proliferação de células cancerígenas. Use um software adequado para observar a proliferação de células cancerígenas em TNEs fluorescentes verdes.
Cultive e core os neutrófilos peritoneais de baixa densidade em uma placa de 35 milímetros, revestida com poli-L-lisina, conforme demonstrado, seguida de uma breve lavagem em 2 mililitros de BSA a 0,1% mais RPMI 1640.
Substitua o meio por 1 vezes 10 elevado a sexto tumor gástrico não corado suspenso em 2 mililitros de RPMI suplementado com BSA para uma incubação de 5 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, enxágue as células em 2 mililitros de RPMI fresco suplementado com BSA por 5 minutos em temperatura ambiente, seguido de um giro suave para remover quaisquer células tumorais soltas.
Em seguida, substitua o sobrenadante por DMEM suplementado com FBS e antibióticos e monte o prato em um sistema de observação de células de visão completa para análise de lapso de tempo do aprisionamento de células tumorais pelos TNEs.