Preparação de bloqueio de exossomos: um protocolo para preservar exossomos de células de câncer de cólon humano cultivadas

Os exossomos são as estruturas vesiculares extracelulares que são secretadas por células cultivadas no sobrenadante. Para preparar um bloco de exossomos, comece tomando um sobrenadante de cultura contendo exossomos em um tubo. Centrifugue o tubo em alta velocidade para peletizar os exossomos intactos. Descarte o sobrenadante restante.

Trate o pellet do exossomo com glutaraldeído presente no tampão de fixação. Incubar a mistura no gelo durante o tempo desejado para preservar a morfologia dos exossomos. O glutaraldeído se infiltra nos exossomos e reticula as proteínas. O tampão de fixação mantém os exossomos em pH neutro para o processo de fixação a jusante.

Descarte o tampão contendo glutaraldeído e adicione a solução de tetróxido de ósmio - um fixador secundário que permeia a bicamada da membrana e fixa os lipídios presentes nos exossomos. Remova a solução de tetróxido de ósmio e trate os exossomos com uma série de concentrações crescentes de acetona. Este processo desidrata os exossomos.

Substitua a acetona absoluta pela mistura de acetona média de incorporação. Gradualmente, aumente a proporção de meio de incorporação nesta mistura.

Despeje a mistura de incorporação contendo exos