Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 3:43 min. • April 30th, 2023
Os exossomos são as estruturas vesiculares extracelulares que são secretadas por células cultivadas no sobrenadante. Para preparar um bloco de exossomos, comece tomando um sobrenadante de cultura contendo exossomos em um tubo. Centrifugue o tubo em alta velocidade para peletizar os exossomos intactos. Descarte o sobrenadante restante.
Trate o pellet do exossomo com glutaraldeído presente no tampão de fixação. Incubar a mistura no gelo durante o tempo desejado para preservar a morfologia dos exossomos. O glutaraldeído se infiltra nos exossomos e reticula as proteínas. O tampão de fixação mantém os exossomos em pH neutro para o processo de fixação a jusante.
Descarte o tampão contendo glutaraldeído e adicione a solução de tetróxido de ósmio - um fixador secundário que permeia a bicamada da membrana e fixa os lipídios presentes nos exossomos. Remova a solução de tetróxido de ósmio e trate os exossomos com uma série de concentrações crescentes de acetona. Este processo desidrata os exossomos.
Substitua a acetona absoluta pela mistura de acetona média de incorporação. Gradualmente, aumente a proporção de meio de incorporação nesta mistura.
Despeje a mistura de incorporação contendo exossomos nos moldes desejados. Seque os moldes no forno em alta temperatura. Isso levará à polimerização do meio de incorporação ao redor dos exossomos, dando origem a blocos.
Para fixar o pellet de exossomo purificado, adicione 1 mililitro de glutaraldeído a 2,5% em uma solução de cacodilato de sódio 0,1 M a pH 7,0. Incube as vesículas de bicamada lipídica por 1 hora a 4 graus Celsius. Em seguida, remova o fixador e enxágue os pellets com 1 mililitro de uma solução tampão de cacodilato de sódio 0,1 M em temperatura ambiente por 10 minutos.
Em seguida, pós-fixar as amostras com 1 mililitro de tetróxido de ósmio a 2% por 1 hora a 4 graus Celsius. Remova o fixador e enxágue o pellet de exossomo três vezes com o tampão de cacodilato de sódio 0,1 M, trocando o tampão a cada 10 minutos. Em seguida, desidrate a amostra agitando-a por 10 minutos cada em uma série de concentrações graduadas de acetona.
Em seguida, misture uma solução de três partes de acetona e uma parte de mistura de incorporação de baixa viscosidade. Substitua a acetona por esta mistura e incube a amostra por 30 minutos. Continue a aumentar a proporção do meio de inclusão de baixa viscosidade, incubando por 30 minutos a cada etapa.
Finalmente, incube o pellet de exossomo em 100% da mistura de incorporação de baixa viscosidade durante a noite à temperatura ambiente. No dia seguinte, incorpore a amostra em mistura de incorporação pura de baixa viscosidade usando um molde de incorporação e asse por 24 horas a 65 graus Celsius.