Isolamento de células mononucleares da lâmina própria: uma técnica de centrifugação por gradiente de densidade à base de sílica para obter células mononucleares do cólon murino

A lâmina própria intestinal, localizada abaixo do epitélio intestinal, consiste em tecido conjuntivo frouxo junto com uma densa rede de fibras colágenas contendo uma gama diversificada de células, como fibroblastos, células mononucleares, incluindo linfócitos e monócitos. Essas células desempenham um papel crucial na manutenção da homeostase.

Para isolar células mononucleares, comece pegando fragmentos de cólon de camundongos. Trate os fragmentos com um tampão de digestão contendo enzimas colagenase. As enzimas colagenase digerem as fibras de colágeno dentro do tecido, liberando as células em suspensão.

Colete o sobrenadante e filtre-o através de filtros de células para remover tecido não digerido e detritos e obter uma suspensão de célula única. Adicione um tampão resfriado ao filtrado para inativar as enzimas colagenase.

Centrifugue para separar as células. Rejeitar o sobrenadante que contém as enzimas e ressuspender o sedimento celular num meio de separação à base de sílica de baixa densidade. Em seguida, coloque a suspensão sobre um meio de separação à base de sílica de alta densidade para criar um gradiente de separação.

Centrifugue a mistura. As células mononucleares sedimentam e formam uma camada branca na interface entre as camadas de gradiente de densidade. Transfira cuidadosamente a camada de interface branca para um novo tubo contendo um tampão adequado.

Centrifugar para obter um pellet contendo células mononucleares purificadas. Ressuspenda o pellet no buffer para posterior análise a jusante.

Para começar, adicione 20 mililitros de tampão de digestão de colagenase ao tubo que contém os fragmentos de cólon lavados. Sele o tubo e coloque-o em um agitador orbital a 37 graus Celsius com uma taxa de rotação de 2 x g por 60 minutos. Certifique-se de que os fragmentos de tecido estejam em constante movimento durante a agitação.

Despeje 5 mililitros de mídia de separação de densidade à base de sílica a 66% em cada um dos três tubos separados de polipropileno de 15 mililitros. Em seguida, use uma pipeta sorológica de 25 mililitros para coletar apenas o sobrenadante da digestão da colagenase 1. Filtre o sobrenadante através de um filtro de células de tecido de filtragem de poros de 40 microlitros colocado em um tubo cônico de polipropileno limpo de 50 mililitros. Encha o tubo completamente com tampão de cólon resfriado para extinguir o tampão de digestão da colagenase. Em seguida, gire as células, aspire o sobrenadante e mantenha o pellet no gelo.

Continue a realizar a Digestão da Colgenase 2 conforme descrito no protocolo de texto. Após a conclusão da digestão da colagenase 2, lave os fragmentos de tecido vigorosamente para frente e para trás entre o tubo e uma seringa de 10 mililitros através de uma agulha de ponta romba 18G. Repita essa lavagem por pelo menos sete a oito passagens, continuando até que nenhum fragmento de tecido grosseiro ou detritos seja visível.

Em seguida, passe a suspensão de desagregação de tecido por um filtro de células de tecido de filtração de poros de 40 micrômetros colocado em um tubo de polipropileno limpo de 50 mililitros. Encha o tubo até a borda com tampão de cólon resfriado para extinguir a digestão e centrifugue a 800 x g e a 4 graus Celsius por 5 minutos.

Descarte o sobrenadante por aspiração a vácuo e puxe o pellet ressuspenso da Digestão da Colgenase 1 para o tubo correspondente. Depois disso, ressuspenda cada pellet em 24 mililitros de meios de separação de densidade à base de sílica a 44% por cólon. Use uma pipeta sorológica de 10 mililitros para colocar lentamente 8 mililitros desse meio em cada um dos três tubos contendo 66% de meios de separação de densidade à base de sílica.

Equilibre cuidadosamente os tubos dentro dos baldes da centrífuga usando uma balança ou balança. Centrifugue a 859 x g e a 20 graus Celsius por 20 minutos sem interrupção. Deixe os rotores pararem completamente antes de remover os tubos, tomando cuidado para não interromper as células na interface gradiente.

Visualize a interface de gradiente perto da marca de 5 mililitros, onde normalmente uma faixa branca de 1-2 milímetros de espessura está presente. Aspire a vácuo e descarte os 7 mililitros superiores do gradiente para permitir um acesso mais fácil da pipeta à interface. Usando sucção manual contínua e movimento rotativo constante do pulso, colete a camada de interface das células. Colete até que a interface entre os dois gradientes esteja clara e refratária e transfira a interface para um novo tubo cônico de polipropileno de 50 mililitros.