Isolamento das glândulas fúndicas gástricas: um método para isolar as glândulas fúndicas do tecido estomacal humano

Em humanos, o fundo é a parte superior do estômago. O epitélio fúndico consiste em numerosas glândulas gástricas que secretam suco gástrico, que auxilia na digestão.

Para isolar as glândulas fúndicas gástricas, comece retirando tecido fúndico humano em um béquer. Adicionar um tampão adequado ao copo e lavar vigorosamente o tecido fúndico. A lavagem remove os detritos contaminantes e o sangue do tecido fúndico.

Transfira o tecido limpo para uma placa de Petri. Usando gaze estéril, limpe a camada mucosa protetora, expondo assim a camada epitelial subjacente. Usando uma pinça, raspe com força a camada epitelial superior do tecido.

Transfira o epitélio raspado para outra placa de Petri e pique-o em pedaços menores. Adicione os pedaços picados a um frasco contendo um tampão suplementado com enzimas colagenase. Incubar à temperatura desejada com agitação constante para evitar grumos.

A colagenase digere as proteínas da matriz extracelular presentes na camada epitelial, liberando as glândulas fúndicas dissociadas em suspensão. Filtrar a suspensão para um tubo novo para remover quaisquer grumos não dissociados.

Mantenha o filtrado glandular intacto no gelo para sedimentar as glândulas. Rejeitar o sobrenadante que contém os restos celulares e ressuspender o sedimento glandular num tampão fresco. Centrifugue e armazene o pellet glandular até o uso posterior.

Para começar, colete o tecido preparado em um grande recipiente de plástico cheio de DPBS sem cálcio / magnésio. Deixe o recipiente de plástico no gelo até o uso. Em seguida, com a ajuda de uma pinça, lave o tecido vigorosamente em um béquer estéril, contendo 100 mililitros de DPBS livre de cálcio / magnésio, por cerca de 30 segundos. Em seguida, use uma gaze estéril para limpar a camada de muco do epitélio.

Em seguida, use uma pinça grande para segurar a camada muscular do tecido com firmeza. Em seguida, use uma grande pinça hemostática curva e raspe o epitélio com força. Armazene o epitélio raspado em uma placa de Petri de poliestireno estéril. Para otimizar a digestão do tecido, pique o tecido epitelial em fragmentos. Em seguida, lave o tecido com DPBS livre de cálcio / magnésio suplementado com antibióticos.

Lave várias vezes para remover o sangue. Descarte a lavagem em um copo de resíduos. Em seguida, recolher os fragmentos epiteliais lavados num balão de vidro de fundo redondo de 125 mililitros com uma barra de agitação de 25 mililitros e meio de incubação pré-aquecido. Depois de recolher os fragmentos de tecido, fechar o balão redondo de fundo com um septo de borracha. Em seguida, insira uma agulha espinhal 20G nos septos. Conecte os septos a um tanque de oxigênio com mangueira de borracha.

Insira 10 a 15 agulhas de saída nos septos para evitar sua ruptura e, em seguida, use clamps para prender a configuração a um suporte de anel. Em seguida, ligue a saída de oxigênio em baixa. Depois disso, calibre o banho-maria a 37 graus Celsius em uma placa de agitação por 30 a 45 minutos. Depois de calibrado, coloque a configuração no banho-maria. Após 15 minutos de incubação, verifique se há glândulas dissociadas.

Após o tempo de incubação desejado, adicione 50 mililitros de DMEM/F-12 pré-aquecido ao meio de incubação usando uma pipeta sorológica. Em seguida, filtre a mistura de glândulas obtida através de uma gaze estéril em quatro tubos cônicos de 50 mililitros. Em seguida, incube o filtrado no gelo por 15 minutos. Isso permitirá que a glândula se acomode no fundo do tubo cônico. Use uma pipeta sorológica para descartar 40 mililitros do sobrenadante do topo da suspensão da glândula.

Ressuspenda os 10 mililitros restantes da mistura de glândulas em 10 mililitros de DPBS suplementado com antibióticos. Em seguida, distribua toda a mistura em tubos de ensaio de cultura de células de 5 mililitros. Centrifugue os tubos a 65 x g por 5 minutos a 4 graus Celsius. Após centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante.