Isolamento de criptas intestinais: um método para isolar criptas inteiras do intestino delgado do modelo murino

O revestimento intestinal é coberto por projeções ou vilosidades e invaginações ou criptas. As criptas são as glândulas intestinais que secretam principalmente enzimas digestivas.

Para isolar criptas do intestino delgado, comece posicionando um camundongo anestesiado em decúbito dorsal em uma placa de dissecação. Usando uma tesoura, disseque o peritônio longitudinalmente para expor o sistema digestivo.

Localize o intestino delgado e puxe-o suavemente para fora do corpo do camundongo. Corte o intestino em sua base. Transfira o intestino colhido para um prato contendo um tampão adequado. Corte o intestino longitudinalmente, expondo o lúmen.

Coloque o intestino, com o lado luminal para cima, em uma tábua de corte para expor as vilosidades. Mova uma lâmina de vidro angular sobre a superfície intestinal para raspar as vilosidades, expondo todas as criptas.

Corte o intestino em pedaços minúsculos e transfira os pedaços para um tubo contendo um tampão gelado para garantir o mínimo de danos às criptas.

Em seguida, trate com EDTA e incuba. O EDTA faz com que todas as criptas se soltem do revestimento intestinal. Remova a solução contendo EDTA gasta. Adicione tampão fresco e triture usando uma pipeta para separar as criptas do revestimento intestinal.

Colete o sobrenadante contendo as criptas em um novo tubo. Completar o tubo com um meio de cultura adequado e centrifugar para esfolar as criptas.

Disseque o peritônio longitudinalmente com uma tesoura. Segure o estômago com a pinça e corte-o transversalmente ao meio usando uma tesoura intestinal deste ponto em diante. Retire o intestino e coloque-o em uma placa de Petri contendo PBS. Comece colocando a ponta romba no estômago e empurre-a suavemente através do piloro.

Prossiga cortando com a tesoura e puxando com a pinça. Uma vez que todo o intestino delgado esteja aberto longitudinalmente, lave-o em PBS frio, segurando-o com a pinça e enxaguando-o suavemente na solução de PBS com movimentos em forma de U. Depois que todos os restos de fezes forem removidos, prossiga para achatar o intestino em uma tábua de corte com o lado luminal para cima.

O lado luminal é facilmente reconhecível pela ausência de vasos sanguíneos e pela sua aparência pálida quando comparado com a parte externa. Com uma lâmina de vidro, removeu suavemente a villa raspando o intestino achatado. Execute esta etapa duas vezes ao longo de todo o comprimento do tecido. Em seguida, corte o intestino delgado com uma lâmina cirúrgica estéril em pedaços de 2 a 5 milímetros.

Coloque os fragmentos do intestino delgado em um tubo de 50 mililitros contendo 10 mililitros de PBS gelado. Limpe os fragmentos de tecido removendo quaisquer impurezas remanescentes pipetando-os para cima e para baixo no PBS. Rejeitar o sobrenadante e repetir este passo até que o PBS esteja completamente limpo. Em seguida, adicione 15 mililitros de PBS frio para elevar o volume final total de PBS para 25 mililitros. Adicione 2 EDTA milimolar e incube por 45 minutos em um rolo a 4 graus Celsius.

Depois de descartar o PBS / EDTA, adicione 10 mililitros de PBS e retire as criptas pipetando duramente os fragmentos de tecido para cima e para baixo. Em seguida, colete o sobrenadante. Repita a etapa quatro vezes. Adicionar meio de cultura até atingir um volume final de 50 mililitros. Pellet as células por centrifugação. Finalmente, ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio de cultura antes de peletizar as criptas por centrifugação.