Pré-tratamento de tecido FFPE para RNA CISH: um procedimento para processar seções de tecido embebidas em parafina fixadas em formalina para hibridização in situ cromogênica de RNA

O pré-tratamento de seções de tecido fixadas em formalina, embebidas em parafina ou FFPE facilita a exposição de ácidos nucléicos e permite a ligação de sondas marcadas à sequência alvo durante a hibridização in situ subsequente. Além disso, o pré-tratamento ajuda a manter a integridade dos ácidos nucléicos dentro das células e a morfologia geral do tecido.

Para começar, pegue uma lâmina de vidro com uma seção de tecido FFPE desparafinizado e reidratado de interesse. Trate o tecido com uma concentração adequada de peróxido de hidrogênio e incuba.

O peróxido de hidrogênio inativa irreversivelmente a peroxidase endógena, que está fisiologicamente presente nas células. Esse processo de bloqueio elimina a possibilidade de sinais de fundo não específicos durante as etapas subsequentes de hibridização.

Em seguida, mergulhe a seção de tecido em um banho aquecido contendo um tampão de recuperação de antígeno apropriado. Incube pela duração desejada. A alta temperatura cliva reticulações químicas induzidas por fixadores em proteínas e ácidos nucléicos, expondo os epítopos desmascarados a sondas durante a marcação subsequente.

Finalmente, trate a amostra com uma solução de protease adequada. Incube em um ambiente com umidade controlada. As proteases aumentam a acessibilidade do RNA, facilitando que as sondas específicas atinjam sua sequência alvo nas etapas de hibridização a seguir.

Lave a seção com água para remover quaisquer proteases residuais. Use a seção de tecido pré-tratado para hibridização in situ cromogênica de RNA.

Para bloquear a atividade da peroxidase em lâminas com seções de tecido previamente desparafinizadas e colocadas em um suporte de lâminas, adicione 4 a 6 gotas, apenas o suficiente para cobrir a amostra, de peróxido de hidrogênio em cada lâmina e incube-as por 10 minutos em temperatura ambiente. Lave as lâminas duas vezes por 2 minutos em água destilada em temperatura ambiente. Para quebrar os limites do tecido de RNA e as seções do tecido, primeiro remova a folha de alumínio do TRR1x em ebulição usando uma garra e pare de mexer.

Mergulhe o suporte deslizante lentamente e com muito cuidado. Cubra o copo novamente com o papel alumínio e incube por 15 minutos. Use a garra para transferir imediatamente o suporte de corrediça quente para um banho-maria destilado e lave-o por 2 minutos. Lave as lâminas em etanol 100% fresco por 2 minutos e deixe-as secar em temperatura ambiente por 2 minutos.

Em seguida, use uma caneta de barreira hidrofóbica para desenhar uma barreira ao redor de cada amostra e deixe secar por pelo menos 5 minutos. Para a digestão da protease, coloque as lâminas na bandeja de controle de umidade e adicione aproximadamente 4 gotas de Protease Plus por amostra. Cubra a bandeja com uma tampa e insira-a no forno de hibridização por 30 minutos a 40 graus Celsius.

Retire a bandeja do forno e remova a grade deslizante. Trabalhando uma lâmina de cada vez, remova rapidamente qualquer excesso de líquido e coloque a lâmina no suporte de lâminas submersa em uma mancha cheia de água destilada. Lave as lâminas duas vezes por 2 minutos em água destilada em temperatura ambiente com agitação constante.

• FFPE tissue – Formalin-fixed paraffin-embedded biological samples used in histopathology.
• Hydrogen peroxide hybridization – A step to block non-specific signal during hybridization.
• Immedge pen – A hydrophobic pen used to create barrier around FFPE tissue on slides.
• Chromogenic Process – A biological technique used to visualize localization of a specific protein.
• CISH Probes – Used for chromogenic in situ hybridization to recognize specific gene sequences.

• Introduce FFPE tissue – Formalin-fixed paraffin-embedded samples used extensively (e.g., FFPE tissue).
• Outline key Concepts – Steps involved for treating and preparing the FFPE tissue samples (e.g., hydrogen peroxide hybridization).
• Underlying Mechanisms – Discuss the role of each step and its significance in the technique (e.g., chromogenic process).
• Connect to Experiment – Usage of CISH probes in the technique to recognize specific gene sequences.

• [Question 1] What is FFPE tissue and how to prepare it?
• [Question 2] What is the importance of hydrogen peroxide hybridization in FFPE tissue preparation?
• [Question 3] How does chromogenic process and CISH probes contribute to in situ hybridization?

• Practical Applications – Usage of FFPE tissue in various histopathology and diagnosis (e.g., FFPE tissue).
• Industry Impact – Fields involving genetic research, pathology, cancer diagnostics (e.g., CISH probes).
• Societal Importance – Improving disease diagnosis leading to better treatments (e.g., FFPE tissue).
• Link to Scientific Advancements – Development of better probes and techniques for gene identification.