Detecção de sinal de RNA CISH: uma técnica para detectar sinais cromogênicos durante a hibridização in situ de RNA em amostras de tecido intacto

Para detectar sinais cromogênicos durante a hibridização de RNA, comece fazendo uma seção de tecido em uma lâmina de vidro. Esta seção contém RNA alvo, pré-hibridizado com sonda de RNA marcada com peroxidase de rábano.

Dispense algumas gotas de diaminobenzidina ou DAB, um substrato de detecção, sobre a seção do tecido e incuba.

O DAB entra na célula e a enzima peroxidase de rábano a oxida para formar um precipitado marrom. Essa reação confere uma cor marrom a sequências específicas de RNA na célula. As células que não contêm RNA alvo não terão atividade de peroxidase e permanecerão sem coloração.

Em seguida, contra-core a seção de tecido com hematoxilina. A hematoxilina se liga ao DNA e confere uma coloração roxa à seção do tecido.

Trate a seção do tecido com água de amônia - uma solução azulada. Reduz a intensidade da mancha roxa, fazendo com que as células pareçam azuis. Esta etapa é essencial para uma visualização clara das manchas marrons dentro das células.

Agora, mergulhe a seção de tecido em concentrações crescentes de etanol e, posteriormente, trate-a com xileno - um solvente orgânico. Essas etapas desidratam a seção de tecido para obter melhores imagens.

Por fim, sele a lâmina com uma solução de montagem e uma lamínula e visualize sob um microscópio de luz. As células exibem pontos marrons pontilhados indicando a presença de RNA alvo.

Dispense o mesmo número de gotas de cada solução DAB-A e DAB-B em um tubo de tamanho apropriado para fazer aproximadamente 120 microlitros de substrato DAB por seção e vórtice. Pegue cada lâmina, uma de cada vez, do suporte de slides e toque e mova para remover o excesso de líquido e coloque-o de volta no suporte de slides. Pipete aproximadamente 120 microlitros de mistura DAB em cada seção de tecido, certificando-se de que as seções estejam cobertas. Incube por 10 minutos em temperatura ambiente e prossiga com a contracoloração.

Coloque uma gota de meio de montagem por ripa de vidro e, em seguida, coloque a ripa nas corrediças e deixe-as secar ao ar. Após algumas horas, prossiga com a avaliação usando um microscópio óptico conforme descrito no manuscrito.

• Chromogenic In Situ Hybridization (CISH) - Technique for detecting RNA or DNA sequences.
• Diaminobenzidine (DAB) - Detection substrate used in CISH testing.
• Horseradish Peroxidase - Enzyme that oxidizes DAB during RNA hybridization.
• Hematoxylin - Stain that binds to DNA during CISH technique.
• Chromogenic Materials - Substances that produce a colour when exposed to radiation.

• Introduce CISH - It's a molecular technique for detecting specific sequences of DNA or RNA (e.g., CISH testing).
• Key Concepts - Horseradish peroxidase oxidizes DAB to create a signal (e.g., CISH technique).
• Underlying Mechanisms - Staining and de-staining processes reveal target RNA (e.g., CISH staining).
• Connect to Experiment - Signals seen under microscope confirm presence of target RNA.

• What is CISH and how does it enable RNA and DNA detection?
• How does the oxidation of DAB works in the CISH technique?
• Why is the staining and de-staining process critical for the CISH procedure?

• Practical Applications - CISH testing aids in disease diagnostics (e.g., biomedical research).
• Industry Impact - Developments in diagnostic techniques (e.g., healthcare).
• Societal Importance - Improves disease detection rates (e.g., public health).
• Link to Scientific Advancements - Continued innovation in chromogenic materials and techniques.