Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 2:42 min. • April 30th, 2023
Para detectar sinais cromogênicos durante a hibridização de RNA, comece fazendo uma seção de tecido em uma lâmina de vidro. Esta seção contém RNA alvo, pré-hibridizado com sonda de RNA marcada com peroxidase de rábano.
Dispense algumas gotas de diaminobenzidina ou DAB, um substrato de detecção, sobre a seção do tecido e incuba.
O DAB entra na célula e a enzima peroxidase de rábano a oxida para formar um precipitado marrom. Essa reação confere uma cor marrom a sequências específicas de RNA na célula. As células que não contêm RNA alvo não terão atividade de peroxidase e permanecerão sem coloração.
Em seguida, contra-core a seção de tecido com hematoxilina. A hematoxilina se liga ao DNA e confere uma coloração roxa à seção do tecido.
Trate a seção do tecido com água de amônia - uma solução azulada. Reduz a intensidade da mancha roxa, fazendo com que as células pareçam azuis. Esta etapa é essencial para uma visualização clara das manchas marrons dentro das células.
Agora, mergulhe a seção de tecido em concentrações crescentes de etanol e, posteriormente, trate-a com xileno - um solvente orgânico. Essas etapas desidratam a seção de tecido para obter melhores imagens.
Por fim, sele a lâmina com uma solução de montagem e uma lamínula e visualize sob um microscópio de luz. As células exibem pontos marrons pontilhados indicando a presença de RNA alvo.
Dispense o mesmo número de gotas de cada solução DAB-A e DAB-B em um tubo de tamanho apropriado para fazer aproximadamente 120 microlitros de substrato DAB por seção e vórtice. Pegue cada lâmina, uma de cada vez, do suporte de slides e toque e mova para remover o excesso de líquido e coloque-o de volta no suporte de slides. Pipete aproximadamente 120 microlitros de mistura DAB em cada seção de tecido, certificando-se de que as seções estejam cobertas. Incube por 10 minutos em temperatura ambiente e prossiga com a contracoloração.
Coloque uma gota de meio de montagem por ripa de vidro e, em seguida, coloque a ripa nas corrediças e deixe-as secar ao ar. Após algumas horas, prossiga com a avaliação usando um microscópio óptico conforme descrito no manuscrito.