Preparação de suspensão de ECM: uma técnica para obter suspensão homogênea de matriz extracelular derivada de tecido
Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 4:16 min. • April 30th, 2023
A matriz extracelular ou MEC, uma complexa rede de suporte nos tecidos, consiste em proteoglicanos e proteínas.
Para obter ECM homogeneizado, comece tomando uma quantidade medida de pó de ECM descelularizado em um tubo. Agora, adicione um tampão acidificado ao tubo para formar uma suspensão ECM.
Simultaneamente, em outro tubo, dissolver a alfa-amilase - uma enzima glicolítica - no mesmo tampão acidificado. O pH ácido deste tampão facilita a atividade ideal da enzima alfa-amilase.
Em seguida, complemente o tubo contendo a suspensão de ECM com solução enzimática de alfa-amilase. Incube o tubo com agitação constante. A alfa-amilase hidrolisa os glicanos - as porções de carboidratos - presentes nos proteoglicanos.
Centrifugue para pellet a fração ECM rica em proteínas, deixando os glicanos digeridos e as enzimas gastas no sobrenadante. Descarte o sobrenadante.
Ressuspenda o pellet em solução de cloreto de sódio. Os íons cloreto extraem as proteínas do pellet ECM para a suspensão. Centrifugue e descarte o sobrenadante contendo cloreto de sódio.
Em seguida, adicione ácido acético ao pellet ECM contendo proteínas. O ácido acético solubiliza ainda mais os agregados de proteínas da ECM e os
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