JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 4:55 min • April 30th, 2023
A invasão perineural ou PNI refere-se à migração de células cancerígenas ao longo dos nervos e sua subsequente invasão no perineuro - um microambiente adequado para o crescimento e metástase do câncer.
Para imitar o PNI in vitro, comece adicionando uma gota de matriz extracelular ou suspensão de ECM em uma placa de cultura de modo que ela assuma a forma de um hemisfério. Agora, incube a placa de cultura para reforçar as características estruturais e funcionais do andaime 3D.
Em seguida, coloque cuidadosamente um gânglio da raiz dorsal pré-colhido ou DRG, um aglomerado de neurônios sensoriais, no centro da gotícula semissólida da MEC. Incube para incorporar o DRG na gota do ECM.
Depois disso, adicione um meio de crescimento adequado e incube. A ECM suplementada com nutrientes favorece o surgimento de DRG em pequenas projeções nervosas chamadas neuritos que crescem radialmente em direção à circunferência da gota.
Remova o meio gasto para preparar a gota ECM para o ensaio subsequente. Semeie células cancerígenas aderentes coradas com fluorescência sobre a gotícula. Devido à forma hemisférica, as células cancerígenas rolam e se instalam ao longo da periferia da gota.
Incube a placa de cultura para permitir a interação entre células cancerígenas e neuritos. Quando vistas ao microscópio de fluorescência, as células cancerígenas podem ser vistas rastreando ao lado dos neuritos e migrando em direção ao DRG, confirmando a invasão perineural.
Para preparar as gotículas de matriz semi-sólida, transfira uma placa de fundo de poço de vidro do gelo para um bloco de gelo sob o microscópio de operação. Coloque a ponta de uma pipeta de no máximo 10 microlitros diretamente no vidro em um ângulo de 45 graus e dispense cuidadosamente uma gota de matriz de 1,5 microlitro no vidro. Afaste lentamente a ponta da pipeta do vidro à medida que a matriz se encaixa na placa.
Deposite uma gota de matriz em cada um dos quatro cantos da placa e transfira a placa para uma superfície em temperatura ambiente por cerca de 1 minuto. Quando a matriz estiver ligeiramente endurecida, retorne a placa ao bloco de gelo e use uma pinça microscópica fechada para colher o DRG suavemente com a mão esquerda.
Usando a mão direita, transfira cuidadosamente o tecido nervoso para a ponta de uma agulha 21G e use a agulha para inserir suavemente o DRG no meio da gota da matriz. O DRG deve ser liberado facilmente na matriz para posicionamento central com a agulha.
Depois de inserir um pedaço de DRG em cada uma das quatro gotículas, coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius por 3 minutos. Quando todo o DRG tiver sido incorporado, segure as placas uma de cada vez em um pequeno ângulo e adicione lentamente 4 mililitros de DMEM suplementado com 10% de FBS às placas, de modo que o meio só gradualmente entre em contato com as unidades de matriz DRG.
Devolva as placas à incubadora por mais 48 a 72 horas. Quando os neuritos atingirem pelo menos 75% do caminho até a borda da matriz, aspire o meio dos poços sem remover as unidades de matriz DRG. Em seguida, usando uma pipeta de 200 microlitros com um gatilho suave, coloque duas gotas de 3 vezes 10 para as quintas células por mililitro de meio sobre cada ensaio DRG da matriz e retorne as placas para a incubadora. Após uma hora, adicione suavemente 4 mililitros de DMEM com 10% de FBS ao longo da parede lateral da placa com fundo de vidro e retorne as placas à incubadora até a próxima avaliação microscópica.