JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 5:22 min • April 30th, 2023
Um tumor contém uma pequena fração de células-tronco conhecidas como população lateral. Essas células são quimiorresistentes, tornando-as responsáveis pela recidiva do câncer.
Para isolar a população secundária de células cancerígenas, comece por adicionar Hoechst - uma solução de corante fluorescente - ao frasco para injetáveis que contém a suspensão de células cancerígenas. Dentro das células cancerígenas normais, as moléculas de Hoechst entram no núcleo e se ligam à região rica em A-T-no no DNA, levando a uma alta fluorescência nessas células.
Em contraste, a população lateral contém uma alta concentração de transportadores ABC - bombas de efluxo que removem rapidamente as moléculas de corante da célula. Esse efluxo ativo de moléculas de corante faz com que a população lateral fluoresça em baixa intensidade.
Agora, pegue outro frasco de células cancerígenas tratadas com Hoechst e adicione Verapamil a ele. Este frasco atua como um controle, pois o Verapamil bloqueia os transportadores ABC. Esta etapa causa uma redução no efluxo de Hoechst e retém o corante dentro das células da população lateral.
Em seguida, contra-core as células em ambos os frascos usando iodeto de propídio. O iodeto de propídio entra exclusivamente no núcleo das células mortas e se intercala entre as bases do DNA. Isso leva a uma alta fluorescência nas células mortas.
Por fim, classifique as células usando um classificador de células ativado por fluorescência ou FACS. O FACS separa as células tumorais altamente fluorescentes e retentoras de Hoechst e as células mortas das células da população lateral de baixa fluorescência.
Para selecionar uma população secundária de células-tronco cancerígenas pelo ensaio de efluxo de corante de Hoechst, primeiro rotule um tubo cônico como "Hoechst" e um "Hoechst e Verapamil". Em seguida, lave uma cultura de células HNSCC com PBS estéril, seguida pela adição de 1 mililitro de tripsina-EDTA. Após 3 minutos a 37 graus Celsius, pare a reação com meio de cultura de células frescas e conte as células. Diluir a cultura para 1 vezes 10 elevado à sétima célula por mililitro em meio de linha celular parental completa.
Em seguida, adicione 100 microlitros ao tubo "Hoechst e Verapamil" e 4 mililitros de células ao tubo "Hoechst". Em seguida, misture suavemente 10 microlitros de solução de cloridrato de Verapamil 5 milimolares na amostra "Hoechst e Verapamil", seguido por 5 microlitros de Hoechst por 1 vezes 10 para as sextas células em ambos os tubos. Em seguida, cubra as amostras com papel alumínio e coloque-as a 37 graus Celsius. Após 90 minutos com mistura suave a cada 15 minutos, centrifugue os tubos e ressuspenda os pellets em 2 mililitros de PBS.
Após uma segunda centrifugação, ressuspender o pellet "Hoechst and Verapamil" em 500 microlitros de iodeto de propídio em PBS e o pellet "Hoechst" em 4 mililitros do mesmo. Agora, filtre as amostras através de filtros de células de 70 mícrons em tubos FACS para remover quaisquer agregados e coloque as amostras no gelo protegido da luz. Em seguida, carregue a amostra "Hoechst" no citômetro de fluxo e abra a janela "Planilha Global" no software do citômetro de fluxo. Clique em "Dot Plot" para criar um gráfico na planilha global e clique com o botão direito do mouse para selecionar os parâmetros de dispersão direta e lateral.
Crie uma dispersão lateral ampla por um gráfico de pontos de altura de dispersão lateral da mesma maneira e clique em "Porta de polígono" para criar uma região P1 no segundo gráfico para selecionar as células individuais e discriminar os dublês. Em seguida, crie uma área Hoechst vermelha por um gráfico de pontos de área Hoechst azul e clique com o botão direito do mouse nas células para destacar a população P1. Em seguida, crie uma região P2 para selecionar a população de células do lado do corante Hoechst negativo que aparece como uma arma secundária à esquerda da população principal de células e colete 10.000 dos eventos de amostra "Hoechst".
Para confirmar se a porta P2 que representa a população lateral está posicionada corretamente, colete também 10.000 eventos de amostra "Hoechst e Verapamil". A população secundária deve desaparecer. Em seguida, classifique a população lateral de células negativas para corante Hoechst em um tubo cônico de 15 mililitros contendo 1 mililitro de meio completo de células-tronco cancerígenas. No final da classificação, gire as células e ressuspenda o pellet da população lateral em 1 mililitro de meio de células-tronco cancerígenas completas frescas. Em seguida, contar as células e semeá-las no número adequado para um novo balão de cultura de células.