Uma plataforma de alta capacidade automatizada para o Desenvolvimento de linhagens celulares para a fabricação de proteínas Therapeutics

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver linhagens celulares para a produção de biológicos com clonalidade e alta produtividade. Isso é alcançado primeiramente transfectando a célula hospedeira com DNA que codifica o gene de interesse. O próximo passo do procedimento é isolar clones de alta produção por meio de triagem, seguido pela documentação da formação de colônias pelo clone select imager.

O passo final consiste em triar e selecionar clones altamente produtivos. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram a produção de anticorpos em cultivos contínuos e em batelada alimentada por meio de cromatografia líquida de fase reversa. Vídeo. A demonstração deste método é essencial, pois as etapas de triagem e pcan 80 dgl são difíceis de aprender devido à configuração complexa envolvida nestes procedimentos; os seguintes cientistas de um laboratório demonstrarão esses procedimentos para transfeção da célula hospedeira, triagem de Jason Sanders para documentação da formação de colônias e Russell Kan para amostragem tecan.

E Eliza Para iniciar este procedimento, um dia antes da transfeção, semeie as células hospedeiras em um frasco de cultura celular com 15 mililitros de meio de crescimento. Incube as células em um incubador a 37 graus Celsius, com 7,5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, prepare os complexos de transfeção: primeiro, dilua oito microgramas de DNA em 800 microlitros de meio de crescimento sem soro em um tubo estéril de microcentrífuga e misture suavemente. Em seguida, dilua 40 microlitros de lip em 800 microlitros de meio de crescimento sem soro em um tubo de poliestireno.

Adicione o DNA diluído ao Lipofectamine diluído. Misture suavemente e incube por 30 minutos à temperatura ambiente para preparar as células hospedeiras para a transfeção. Remova o meio de crescimento das células e substitua por 6,4 mililitros de meio de crescimento sem soro.

Adicione 1,6 mililitros dos complexos de transfeção ao frasco. Misture suavemente balançando o frasco. Incube as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono por seis horas.

Após seis horas, adicione oito mililitros de meio de crescimento ao frasco e incube a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono durante a noite no dia seguinte. Remova o meio por aspiração e adicione meio de crescimento fresco ao frasco. Incube as células durante a noite novamente após a incubação noturna.

Substitua o meio de crescimento pelo meio de seleção. Incube as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono por duas a três semanas. Duas a três semanas após a transfeção, as células estarão prontas para clonagem por citometria de fluxo; solte as células do frasco e centrifugue a 800 RPM por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Resuspenda as células no meio de seleção, suplementado com 2% de albumina sérica bovina. Em seguida, adicione o anticorpo anti-IgG humano marcado com fluoróforo. Adicione uma diluição de um para 20, incube no gelo por 15 a 30 minutos e, então, lave duas vezes com PBS frio. Resuspenda as células em um volume de PBS em um tubo de polipropileno.

Um exemplo de células coradas é mostrado nesta imagem para classificação asséptica em um BD FACS Aria. Prepare uma placa de cultura celular de 96 poços que contenha 200 microlitros de meio de seleção em cada poço. Carregue assépticamente o tubo com as células e analise no BD FACS Aria, registrando os resultados para células coradas e não coradas, respectivamente.

Configure os gates e ajustes para classificar células individuais com o perfil desejado de marcação fluorescente na placa de 96 poços. Incube a placa em um incubador a 37 graus Celsius por duas semanas. Nos dias zero, três, sete e 13 após a classificação celular, documente a formação de colônias na placa de 96 poços utilizando um clone select imager, para garantir a seleção de colônias derivadas de uma única célula, a fim de triar e selecionar clones altamente produtivos. Primeiro, registre a posição da amostra na placa de ensaio receptora de 96 poços. Em seguida, utilize um sistema robótico de manipulação líquida para transferir alíquotas de 20 microlitros de sobrenadante para cada poço da placa de ensaio de 96 poços. A produção de anticorpos nas amostras é analisada por ensaio tipo sanduíche.

ELISA para detecção de IgG humana no sistema de manipulação líquida da seguinte maneira. Primeiro, as amostras e um padrão são carregados em placas de ensaio pré-codificadas com revestimento biológico anti-IgG humana. As placas são incubadas à temperatura ambiente por duas horas, seguidas por três lavagens com PBS.

Em seguida, adiciona-se aos poços o anticorpo secundário de cabra anti-Ig humana purificado imunologicamente conjugado à fosfatase alcalina, em uma diluição de 1 para 2000, e os poços são incubados por uma hora à temperatura ambiente. Após uma hora, os poços são lavados três vezes com PBS e, então, adiciona-se o substrato A BTS.

Por fim, as placas são lidas em um leitor de placas utilizando absorbância a 405 nanômetros para detecção. Usando esta plataforma automatizada, descobriu-se que o nível de anticorpos na superfície, indicado pela coloração com anti-IgG humano marcado com fluoróforo, correlaciona-se com a produtividade de anticorpos da célula. Como mostrado aqui para os dois melhores clones gerados a partir da população celular com alta expressão de anticorpos na superfície, a produtividade específica variou de 50 a 70 picogramas por célula por dia.

Em contraste, a produtividade de anticorpos foi de aproximadamente 20 picogramas por célula por dia para os dois melhores clones gerados a partir da população celular com baixa expressão de anticorpos na superfície. Além disso, linhagens celulares desenvolvidas por triagem por fatores são mais estáveis em relação à produção de anticorpos do que aquelas clonadas por diluição limitante manual. A produtividade específica do melhor clone, o clone um, gerado por diluição limitante manual, caiu de aproximadamente 30 PCD para cerca de 10 PCD após o cultivo por 80 duplicações celulares.

Por outro lado, o subclone superior gerado pela clonagem por ordenação de fax manteve a produtividade específica em torno de 20 PCD por pelo menos 100 duplicações celulares. A identificação do local de integração do transgene no cromossomo celular por hibridização in situ fluorescente demonstrou que o clone um é uma população mista de fenótipo A e fenótipo B. Em contraste, o clone ordenado por fax pareceu ser uma população mais homogênea, com 99,5% das células apresentando o fenótipo A. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como desenvolver linhagens celulares para produção de proteínas terapêuticas.