Uma plataforma de alta capacidade automatizada para o Desenvolvimento de linhagens celulares para a fabricação de proteínas Therapeutics

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver linhagens celulares de fabricação para biológicos com clonalidade e alta produtividade. Isso é feito primeiro transeccionando a célula hospedeira com DNA, codificando o gene de interesse. A próxima etapa do procedimento é isolar clones de alta produção por fatos, seguido pela documentação da formação de colônias pelo imageador de seleção de clones.

A etapa final é selecionar clones altamente produtivos. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a produção de anticorpos em culturas contínuas e alimentadas em batelada por meio de HPLC de fase reversa. Vídeo. A demonstração deste método é crítica, pois a classificação de fatos e as etapas de 80 dgl do pcan são difíceis de aprender porque uma configuração complexa está envolvida nesses procedimentos, os seguintes cientistas de um laboratório demonstrarão esses procedimentos para a transfecção do efeito da célula hospedeira, classificando Jason Sanders para documentação da formação de colônias e Russell Kan para amostragem de tecano.

E Eliza Para iniciar esse procedimento um dia antes da transfecção, semeie as células hospedeiras em um frasco de cultura de células em 15 mililitros de crescimento. Média. Incube as células em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius, 7,5% no dia seguinte, prepare os complexos de transfecção primeiro dilua oito microgramas, DNA em 800 microlitros de meio de crescimento sem soro em um tubo de microcentrífuga estéril misturado suavemente. Em seguida, dilua 40 microlitros de lábio em 800 microlitros de meio de crescimento sem soro em um tubo de poliestireno.

Adicione o DNA diluído à lipofectamina diluída. Misture delicadamente e incube por 30 minutos em temperatura ambiente para preparar as células hospedeiras para a transfecção. Remova o meio de crescimento das células e substitua por 6,4 mililitros de meio de crescimento sem soro.

Adicione 1,6 mililitros dos complexos de transfecção ao frasco. Misturar delicadamente, agitando o balão. Incube as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono por seis horas.

Após seis horas, adicione oito mililitros de meio de crescimento ao frasco e incube a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono durante a noite no dia seguinte. Remover o meio por aspiração e adicionar o meio de crescimento fresco ao balão. Incube as células durante a noite novamente após a incubação durante a noite.

Substitua o meio de crescimento por seleção. Média. Incube as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono por duas a três semanas. Duas a três semanas após serem transfectadas, as células estão prontas para clonagem por citometria de fluxo, classificação celular ativada, células desalojadas do frasco e centrifugação a 800 RPM por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Ressuspenda as células em meio de seleção, suplementado com albumina de soro bovino a 2%. Em seguida, adicione anticorpo IgG anti-humano marcado com fluorescência. Adicione uma diluição de um a 20 incubar no gelo por 15 a 30 minutos e, em seguida, lave duas vezes com células ressuspendidas de PBS frias em um XPBS em um tubo de polipropileno.

Um exemplo de células coradas é mostrado nesta imagem para classificação asséptica em uma ária de fax BD prepare uma placa de cultura de células de 96 poços que contém 200 microlitros de meio de seleção em cada poço. Carregue assepticamente o tubo com células e analise os fatos do BD. Aria, registre os resultados para células coradas e não coradas, respectivamente.

Defina as portas e configurações para classificar células únicas do perfil de coloração fluorescente desejado na placa de 96 poços incubar a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius por duas semanas no dia zero, dia três, dia sete e dia 13 após a classificação de fatos documentar a formação de colônias na placa de 96 poços em um gerador de imagens de seleção de clone para garantir a seleção de clones derivados de uma única célula para triagem e seleção para altamente produtivo Clones. Primeiro documente a posição da amostra na placa de ensaio de 96 poços receptores. Em seguida, use um sistema robótico de manuseio de líquidos para transferir alíquotas de sobrenadante de 20 microlitros para cada poço da produção de anticorpos em placa de ensaio de 96 poços nas amostras é analisada por um sanduíche.

IgG humana que deteta ELI SA no sistema de tratamento de líquidos da seguinte forma. Primeiro, as amostras e um padrão são carregados em placas de ensaio anti-IgG anti-revestimento biológico pré-codificadas. As placas são incubadas à temperatura ambiente por duas horas, seguidas de três lavagens de PBS.

Em seguida, IgG anti-humana de cabra imunopura. O HRP é adicionado às placas em uma diluição de um a 2000 e as placas são incubadas por uma hora à temperatura ambiente. Após uma hora, as placas são lavadas três vezes com PBS e, em seguida, o substrato A BTS é adicionado.

Finalmente, as placas são vermelhas em um leitor de placas usando absorbância a 405 nanômetros para detecção. Usando essa plataforma automatizada, descobriu-se que o nível de anticorpos de superfície refletido pela coloração com IgG anti-humana marcada com fluorescência se correlaciona com a produtividade de anticorpos da célula. Como mostrado aqui para os dois principais clones gerados a partir da população de células com alta expressão de anticorpos de superfície, a produtividade específica variou de 50 a 70 picogramas por célula por dia.

Em contraste, a produtividade de anticorpos foi de aproximadamente 20 picogramas por célula por dia para os dois principais clones gerados a partir da população de células com baixa expressão de anticorpos de superfície. Além disso, as linhagens celulares desenvolvidas por classificação de fatos são mais estáveis em relação à produção de anticorpos do que aquelas que foram clonadas por meio de diluição limitante manual. A produtividade específica do clone superior gerado pela diluição limitante manual caiu de aproximadamente 30 PCD para cerca de 10 PCD após o cultivo para duplicações de 80 células.

Por outro lado, o subclone superior gerado pelo clone dois de classificação por fax foi capaz de manter a produtividade específica em torno de 20 PCD para pelo menos 100 duplicações de células. A identificação do local de integração do transgene no cromossomo celular por hibridização in situ fluorescente demonstrou que o clone um é uma população mista de fenótipo A e fenótipo B.In contraste, o clone classificado de fato parecia ser uma população mais homogênea com 99,5% das células do fenótipo A. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como desenvolver linhas celulares de fabricação para a proteção de proteínas terapêuticas.