Name: Uma plataforma de alta capacidade automatizada para o Desenvolvimento de linhagens celulares para a fabricação de proteínas Therapeutics (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Aprenda a desenvolver linhagens celulares automatizadas para produção de proteínas terapêuticas usando citometria de fluxo e imagem de colônias. Este método melhora a produtividade e estabilidade das células.

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1. Transfecção da célula hospedeira <ol><li> Semente de 2 x 10 6 células CHO-DXB11 no frasco de cultura de células T75 Corning em 15 ml meio de crescimento (MEMA com nucleotídeos e nucleosídeos (Gibco, número de catálogo 12571) suplementado com 10% γ irradiados caracterizada soro fetal bovino (cFBS) (HyClone, número de catálogo SH30071.03) e 10 mL / L de solução de glicose 45% (Sigma, número de catálogo G8769)) um dia antes de transfecção. </li><li> No momento da transfecção, preparar complexos de transfecção da seguinte forma: <ol class="lalpha"><li> Diluir 8 DNA mg em 800 mL de meio de crescimento sem soro em um tubo de microcentrífuga estéril. Misture delicadamente. </li><li> Diluir 40 mL Lipofectamine ™ (Invitrogen 18324012) em 800 mL de meio de crescimento sem soro em um tubo de poliestireno. </li><li> Adicione o DNA diluído para o ™ Lipofectamine diluída. Misture delicadamente e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Remova o meio de crescimento de células em T75 e substituir, com 6,4 ml de meio de crescimento sem soro. Adicione o ml 1,6 de complexos de transfecção ao balão. Misture delicadamente balançando a placa. </li><li> Incubar as células a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 por 6 horas. </li><li> Adicionar 8 ml de meio de crescimento para o balão e incubar a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 durante a noite. </li><li> Remova o meio de aspiração e adicione meio de crescimento frescas para o balão. Incubar as células a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 durante a noite. </li><li> Substituir o meio de crescimento com meio de seleção (MEMA meio sem nucleotídeos ou nucleosídeos (Gibco, número de catálogo 12561) suplementado com 10% γ irradiados soro fetal bovino dialisado (DFBS) (HyClone, número de catálogo SH30079.03) e 10 mL / L 45 solução de glucose% (Sigma, código G8769)). </li><li> Incubar as células a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 por 2-3 semanas. </li></ol> 2. Clonagem por separação de células Fluxo Citometria Activated <ol><li> Desalojar as células do frasco e centrifugar a 800 rpm por 5 minutos a 4 ° C. </li><li> Ressuspender as células em meio de seleção suplementado com 2% de albumina sérica bovina e fluorescente etiquetado anticorpos IgG anti-humano na diluição de 1:20. </li><li> Incubar no gelo por 15-30 minutos e depois lave duas vezes com PBS frio. Ressuspender as células em 1x PBS em um tubo de polipropileno. </li><li> Prepare-se para classificar asséptica em um FACSAria BD ™. Prepare de 96 poços da placa de cultura de células que contém 200 mL meio de seleção em cada poço. </li><li> Assepticamente carregar o tubo com as células e analisar em BD FACSAria ™, registrar os resultados para as células manchadas e sem manchas, respectivamente. </li><li> Definir as portas e as configurações para classificar uma única célula do perfil desejado de fluorescência de coloração em 96 poços da placa (s). <ol class="lalpha"><li> Células transfectadas são primeiramente analisados ​​com base na dispersão frontal versus dispersão lateral. Um portão de células vivas é feita com base na dispersão para a frente, que mede o tamanho de uma célula, e dispersão lateral, que mede a complexidade de uma célula ou granularidade. </li><li> As células que se enquadram nesta portão são então analisados ​​para a coloração de PE. PE portão negativo é definido para unstained células transfectadas ou células hospedeiras manchado. Como as células marcadas transfectadas são examinados pelo FACS, o "High PE" gate é então delineada para abranger o top 5% de todas as células que são positivos para a coloração de PE. </li></ol></li><li> Incubar as placas em 37 ° C incubadora por duas semanas. </li></ol> 3. Documentação de formação de colônia por CloneSelect ™ Imager Formação de documento colônia em placas de 96 poços na CloneSelect Imager ™ no dia 0, dia 3, dia 7 e dia 13 após FACS classificação. A documentação imagem vai garantir a selecção de clones derivados de uma única célula. Um passo fundamental nesta documentação está recebendo o plano focal ajustados corretamente para a medição dia 0, uma vez que existe apenas uma célula em cada poço a esse ponto. É muito importante que as imagens dessas células individuais estão em foco e tentar ajustar o foco sobre eles pode ser enganosa na melhor das hipóteses. O plano focal pode variar significativamente entre as marcas de placas e possivelmente até mesmo de lote para lote da mesma marca. Assim, um plano pré-determinado focal precisa ser usado. Isso pode ser feito concentrando-se em teste de micro-grânulos ou células de alta densidade depositados em placas do mesmo lote a ser utilizado. Alternativamente, as placas totalmente crescido a partir do mesmo lote pode ser utilizado para este fim. Depois FACS classificação, também é importante para permitir que as células se contentar com um mínimo de 2 horas antes da imagem, de modo que eles serão "fixo" na posição na chapa. 4. Triagem e seleção de clones altamente produtivos <ol><li> Posição documento de amostra no recebimento placas de 96 poços ensaio. </li><li> Alíquotas transferência de 20 mL sobrenadante (diluir, se necessário) em placas de 96 poços de ensaio pela Liberdade TECAN EVO ® sistema de manipulação de líquidos. Este robô flexível e capazplataforma IC foi adaptado para este trabalho e outra cultura automatizada de células. Programas especiais foram escritos para melhor utilizar e melhorar as capacidades Freedom EVO robótica para o desenvolvimento de linhagem celular. Um exemplo disso é a criação do TECAN para interpretar dados CloneSelect Imager ™ para amostragem de poços com colônias único. Outros programas foram necessários para executar tarefas adicionais de células da cultura, como fazer as diluições apropriadas das amostras colhidas, de interpretar, catálogo e placas de amostra manualmente marcados, se necessário, para aumentar os clones de alta produção, etc Muitos destes programas pode ser facilmente aplicado a 384 placas bem como bem como o formato de 96 poço original. </li><li> Produção de anticorpos nas amostras é analisada por um sanduíche de IgG humana detecção de ELISA (Pierce, Rockford, IL) sobre a liberdade TECAN EVO ® sistema de manipulação de líquidos. <ol><li> Amostras e standard (Human mieloma IgG1, kappa) (Sigma, St. Louis, MO) foram carregados em pré-revestidas Bio Brasão anti-humano IgG Placas Assay (BD Biosciences, San Jose, CA). </li><li> As placas foram incubadas em temperatura ambiente por duas horas seguido de três lavagens PBS. </li><li> ImmunoPure Goat Anti-IgG humana (Fc-gama)-HRP (Pierce, Rockford, IL) foi adicionado à placa na diluição de 1:2000 e incubados por uma hora em temperatura ambiente. </li><li> As placas foram lavadas três vezes com PBS antes de adicionar ABTS substrato (Pierce, Rockford, IL) e foram lidas em um leitor de placas utilizando absorvância a 405 nm para a detecção. </li></ol></li><li> Selecionar clones altamente produtivos e avaliar a produtividade na cultura de suspensão. Para fed-batch cultura, as células foram inoculadas em 0.3X106 células / mL em meio livre de proteína ADVANTAGE JRH IMEDIATA 65.578 (SAFC Biosciences, Lenexa, KS), suplementado com 5 g / L de soja hidrolisado (DMV International, número de catálogo SE50MAF-UF muito, número) e incubados a 37 ° C com 7,5% de CO 2. A cultura continuou e foram suplementados com 2 g / L de glicose (Sigma, código G8769, número de lote 098K2329) quando glicose mais concentração de lactato na cultura chegou abaixo de 2 g / L, e 2 alimentados mM de glutamina (Gibco, número de catálogo 25030, número do lote 568177), quando os níveis de glutamina chegou abaixo de 200 mg / L (metabólitos medidos por YSI Bioanalyzer). Fed-batch culturas foram encerradas no dia 14 ea produção de anticorpos foi medida por HPLC fase reversa. </li><li> Caracterização genética de clones candidato por hibridização fluorescente in situ (FISH) 5. </li></ol> 5. Resultados representativos: Um exemplo de desenvolvimento de anticorpos produzir clones com o método de alto rendimento é mostrado na Figura 1 e Figura 2. Pool de células transfectadas foi corado com fluorescente etiquetado anticorpos IgG anti-humano (Figura 1A), analisados ​​e classificados em BD FACSAria ™ (Figura 1B). Formação de colônias em placa de 96 poços foi fotografada em CloneSelect Imager ™ (Figura 1C). Sobrenadante de cultura de células foi amostrado de poços que contêm única colônia e analisados ​​por ELISA no EVO Liberdade TECAN ® sistema de manipulação de líquidos (Figura 1D). Clones altamente produtivos foram encontrados a partir de células que apresentaram maior nível de anticorpo de superfície refletida pela coloração fluorescente com anticorpo anti-IgG humana. Quando se comparam clones gerados a partir de duas populações do pool de células transfectadas inicial, uma grande diferença na produtividade em cultura em batelada alimentada foi observada (Figura 2). Para os dois primeiros clones gerados a partir da população de células com alta expressão de superfície de anticorpos (PE alta), a produtividade específica variou 50-70 pg / célula / dia. Considerando que a produtividade de anticorpos foi de ~ 20 pg / célula / dia para os dois clones gerados a partir da população de células com baixa expressão de superfície de anticorpos (PE baixo). Além disso, linhagens de células desenvolvidas pela classificação FACS são mais estáveis ​​em relação à produção de anticorpos do que aqueles que foram clonados por diluição calagem manual (Figura 3A). A produtividade específica do clone de topo, "Clone 1", gerado por diluição manual de calagem caiu de ~ 30 para ~ 10 pcd pcd após o cultivo de 80 duplicações celulares. Por outro lado, a top subclone gerados por FACS classificação, "Clone 2", foi capaz de manter a produtividade específica em torno de 20 pcd para pelo menos 100 duplicações celulares. Por hibridização fluorescente in situ (FISH), demonstramos Clone 1 mostrou como uma população mista de fenótipo A (85%) e fenótipo B (15%). Em contraste, FACS classificadas clone (clone 2) mostrou-se uma população mais homogênea, com 99,5% das células mostrou-se fenótipo A. (Figura 3B) <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Desenvolvimento de linhas de produção de células para a produção de anticorpos monoclonais a partir de células CHO. A) coloração da superfície da piscina célula inicial transfectadas com fluorescente etiquetado anticorpos IgG anti-humano. B) A classificação da população de células com alta intensidade de fluorescência (PE de alta) e baixa intensidade de fluorescência (PE baixo) em placa de 96 poços. C) Documentar colôniaformação desde o primeiro dia pós-semeadura de 0 a 13 dias em CloneSelect Imager ™. D) Screening clones por ELISA. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Superfície nível de anticorpos associados se correlaciona com a produtividade de anticorpos da célula. Clones com alta e baixa coloração fluorescente foram desenvolvidos em linhas celulares e avaliados em cultura em batelada alimentada. Volumétrica título e produtividade foram comparadas entre os top 2 clones de cada população. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Clones gerados a partir de FACS classificação exibem maior homogeneidade genética e estabilidade clone. A) a estabilidade da produção de anticorpos em cultura de lote para ~ 80 duplicações celulares de tempo decorrido cultura. Δ, clone foi gerada através da diluição limitante, onde as células foram semeadas em 2000 células / poço, 1000 células / poço e 500 células / poço. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010triangle.jpg" alt="Triângulo Negro" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Triângulo preto"> , Clone foi gerada através de FACS em 1 célula / poço. B) Transgene sítio de integração no cromossomo CHO célula é identificada por hibridização fluorescente in situ.

<ol><li>Hung, F., Deng, L., Ravnikar, P., Condon, R., Li, B., Do, L., Saha, D., Tsao, Y. S., Merchant, A., Liu, Z., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+stability+and+antibody+production+in+CHO+cells%3A+improvement+through+gene+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">mRNA stability and antibody production in CHO cells: improvement through gene optimization.</a> Biotechnol. J. 5, 393-401 (2010).</li>
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Os autores deste artigo são funcionários da Inc., Merck &amp; Co., que utilizam este método para a produção em larga escala de proteínas terapêuticas a partir de linhas de células de mamíferos.

Nós apresentamos um sistema automatizado de fabricação de células plataforma de desenvolvimento de linha que permite o isolamento de clones altamente produtivos, e na média, enquanto garante clonalidade e estabilidade clone. A contratação de coloração anticorpo de superfície seguido por separação de células FACSAria ™ é a chave para a obtenção de clones único com produtividade elevados de anticorpos. Nossos resultados e outros relatórios 2-4 sugerem que o nível de anticorpos transitoriamente exibido na superfície da célula bem correlacionados com a produtividade da célula. Assim, um anticorpo conjugado com fluoresceína pode ser usada para reconhecer o produto membrana associados e ajuda o isolamento de grandes produtores. Alternativamente, co-expressão de genes repórter e tecnologia microdrop gel têm sido usados ​​para facilitar a seleção de clones de alta produção por FACS 6-8. Além de isolar clones de alta produção via FACS, outras tecnologias têm evoluído para atingir o mesmo objetivo. Estes incluem Trellis tecnologia CellSpot Bioscience que usa sistemas de detecção de anticorpos microspere e tecnologia a laser de triagem para identificar clones altamente produtivos e eliminar células indesejáveis, Genetix ClonePix FL e StemCell Technologies ClonaCell plataforma EasyPick que realizar a triagem de alto rendimento de linhas de produção de células usando um sistema de detecção de anticorpo fluorescente . Optamos por implementar o método de clonagem FACS com base na superfície nível de anticorpos associados, porque combina a facilidade de operação, a seletividade na produtividade e clonalidade. O emprego de TECAN EVO ® Freedom sistema de manipulação de líquidos aumentaram significativamente throughput screening, que oferecem a oportunidade de selecionar clones de alto rendimento a partir de um pool de células muito maiores. Outros instrumentos para o ensaio, como HTRF, BioForte Octet, HPLC, etc, são todos os meios possíveis de selecionar os produtores de alta e triagem para produtores de baixa. Acompanhando a formação de clone com CloneSelect Imager ™, geramos documentação necessária para provar clonalidade com a história digitalizados linha celular. Clonalidade é ainda confirmada por caracterizar geneticamente único sítio de integração do transgene no cromossomo. Um passo subclonagem, que normalmente é tomado para assegurar clonalidade, pode assim ser eliminado. Isso vai poupar 4-8 semanas de tempo para o desenvolvimento de linhagem celular. Em resumo, as linhas de células de qualidade gerados pela plataforma de alto rendimento automatizada mostrou alta produtividade, estabilidade de produção e história documentada linha de células que devem atender à demanda de produção em larga escala e atuais exigências regulamentares.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td></tr><tr><td> BD FACS Aria ™ Sorter celular </td><td> BD Bioscience </td></tr><tr><td> CloneSelect ™ Imager </td><td> Genetix </td></tr><tr><td> TECAN Freedom EVO ® sistema de manuseio de líquidos </td><td> Tecan Grupo </td></tr></tbody></table>

uma plataforma de alta capacidade automatizada para o desenvolvimento de linhagens celulares para a fabricação de proteínas therapeutics

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

A indústria biofarmacêutica rápido crescimento demandas rápido desenvolvimento de sistemas de produção altamente eficiente e confiável para atender a necessidade crescente de fornecimento de medicamentos. A geração de linhagens de células de produção tradicionalmente envolvidos operações manuais que são de trabalho intensivo e de baixo rendimento e vulnerável a erros humanos. Nós relatamos aqui uma plataforma integrada de alto rendimento e automatizados para o desenvolvimento de linhas de fabricação de células para a produção de proteínas terapêuticas. A combinação de BD FACS Aria ™ Sorter Cell, CloneSelect ™ Imager e TECAN Freedom EVO ® sistema de manipulação de líquidos, permitiu um alto rendimento e mais eficiente processo de desenvolvimento de células de linha. Nesta operação, células hospedeiras de produção são os primeiros transfectadas com um vetor de expressão com o gene de interesse 1, seguido pelo tratamento com um agente de seleção. As células estavelmente transfectadas são então marcadas com fluorescência rotulados de anticorpos IgG anti-humanos, e são posteriormente sujeitas a análise de citometria de fluxo 2-4. Células altamente produtivas são selecionados com base na intensidade de fluorescência e são isoladas por uma única célula de classificação em um FACSAria BD ™. Formação de colônias a partir de uma única célula estágio foi detectada ao microscópio e uma série de imagens em tempo-voltas digitais são tomadas por CloneSelect ™ Imager para a documentação da história da linhagem celular. Depois de clones único formaram, estes clones foram selecionados para a produtividade por ELISA realizado em Liberdade TECAN EVO ® sistema de manipulação de líquidos. Aproximadamente 2.000 - 10.000 clones podem ser rastreados por ciclo de operação com a configuração atual do sistema. Esta abordagem integrada tem sido utilizada para gerar alta produção ovário de hamster chinês linhas (CHO) de células para a produção de anticorpos monoclonais terapêuticos (mAb), bem como suas proteínas de fusão. Com a ajuda de diferentes tipos de sondas de detecção, o método pode ser usado para o desenvolvimento de terapias protéicas outros ou ser aplicada a sistemas outro host de produção. Comparando com o procedimento manual tradicional, esta plataforma automatizada demonstrado vantagens da capacidade significativamente aumentada, clonalidade assegurada, rastreabilidade na história linha celular com documentação eletrônica e oportunidade muito reduzida no erro do operador.

A alta taxa de transferência de plataforma, desenvolvimento, fabricação automatizada de células da linha para a produção de proteínas terapêuticas é descrito. Implementação de BD Sorter celular FACS Aria, CloneSelect Imager e TECAN Freedom EVO sistema de manipulação de líquidos tem demonstrado capacidade de processamento aumentou significativamente no desenvolvimento de linhagem de células com melhor qualidade de células de linha e alta reprodutibilidade.

Uma plataforma de alta capacidade automatizada para o Desenvolvimento de linhagens celulares para a fabricação de proteínas Therapeutics

A indústria biofarmacêutica, em rápido crescimento, exige o desenvolvimento célere de sistemas de produção altamente eficientes e confiáveis para atender à crescente...

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver linhagens celulares para produção de biológicos com clonalidade e alta produtividade. Isso é realizado primeiramente transfectando a célula hospedeira com DNA que codifica o gene de interesse. O próximo passo do procedimento é isolar clones de alta produção por meio de triagem, seguido pela documentação da formação de colônias pelo clone select imager.O passo final consiste em triar e selecionar clones altamente produtivos. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram a produção de anticorpos em cultivos contínuos e em batelada alimentada por meio de cromatografia líquida de fase reversa. Vídeo. A demonstração deste método é essencial, pois as etapas de triagem e pcan 80 dgl são difíceis de aprender devido à configuração complexa envolvida nestes procedimentos; os seguintes cientistas de um laboratório demonstrarão esses procedimentos para transfeção da célula hospedeira, triagem de Jason Sanders para documentação da formação de colônias e Russell Kan para amostragem tecan.E Eliza Para iniciar este procedimento, um dia antes da transfeção, semeie as células hospedeiras em um frasco de cultura celular com 15 mililitros de meio de crescimento. Incube as células em um incubador a 37 graus Celsius, com 7,5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, prepare os complexos de transfeção: primeiro, dilua oito microgramas de DNA em 800 microlitros de meio de crescimento sem soro em um tubo estéril de microcentrífuga e misture suavemente. Em seguida, dilua 40 microlitros de lip em 800 microlitros de meio de crescimento sem soro em um tubo de poliestireno.Adicione o DNA diluído ao Lipofectamine diluído. Misture suavemente e incube por 30 minutos à temperatura ambiente para preparar as células hospedeiras para a transfeção. Remova o meio de crescimento das células e substitua por 6,4 mililitros de meio de crescimento sem soro.Adicione 1,6 mililitros dos complexos de transfeção ao frasco. Misture suavemente balançando o frasco. Incube as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono por seis horas.Após seis horas, adicione oito mililitros de meio de crescimento ao frasco e incube a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono durante a noite no dia seguinte. Remova o meio por aspiração e adicione meio de crescimento fresco ao frasco. Incube as células durante a noite novamente após a incubação noturna.Substitua o meio de crescimento pelo meio de seleção. Incube as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono por duas a três semanas. Duas a três semanas após a transfeção, as células estarão prontas para clonagem por citometria de fluxo; solte as células do frasco e centrifugue a 800 RPM por cinco minutos a quatro graus Celsius.Resuspenda as células no meio de seleção, suplementado com 2% de albumina de soro bovino. Em seguida, adicione o anticorpo anti-IgG humano marcado com fluoróforo. Adicione uma diluição de um para 20, incube no gelo por 15 a 30 minutos e, depois, lave duas vezes com PBS frio. Resuspenda as células em um volume de PBS em um tubo de polipropileno.Um exemplo de células coradas é mostrado nesta imagem para classificação asséptica em um BD FACS Aria. Prepare uma placa de cultura celular de 96 poços que contenha 200 microlitros de meio de seleção em cada poço. Carregue assépticamente o tubo com as células e analise no BD FACS Aria, registrando os resultados para células coradas e não coradas, respectivamente.Configure os gates e as configurações para separar células individuais com o perfil desejado de marcação fluorescente na placa de 96 poços; incubar a placa em um incubador a 37 graus Celsius por duas semanas. Nos dias zero, três, sete e 13 após a separação celular, documentar a formação de colônias na placa de 96 poços usando um clone select imager, para garantir a seleção de colônias derivadas de uma única célula, a fim de triar e selecionar clones altamente produtivos. Primeiro, registre a posição da amostra na placa de ensaio receptora de 96 poços. Em seguida, utilize um sistema robótico de manipulação líquida para transferir alíquotas de 20 microlitros de sobrenadante para cada poço da placa de ensaio de 96 poços. A produção de anticorpos nas amostras é analisada por ensaio tipo sanduíche.ELI SA de detecção de IgG humana no sistema de manipulação de líquidos da seguinte maneira. Primeiro, as amostras e um padrão são carregados em placas de ensaio pré-codificadas com revestimento biológico anti-IgG humana. As placas são incubadas à temperatura ambiente por duas horas, seguidas por três lavagens com PBS.Em seguida, adiciona-se aos poços imunoglobulina pura de cabra anti-IgG humana conjugada à HRP, em uma diluição de 1:2000, e os poços são incubados por uma hora à temperatura ambiente. Após uma hora, os poços são lavados três vezes com PBS e, em seguida, adiciona-se o substrato A BTS.Por fim, as placas são lidas em um leitor de placas utilizando absorbância a 405 nanômetros para detecção. Usando esta plataforma automatizada, descobriu-se que o nível de anticorpos na superfície, indicado pela coloração com anti-IgG humano marcado com fluoróforo, correlaciona-se com a produtividade de anticorpos da célula. Como mostrado aqui para os dois melhores clones gerados a partir da população celular com alta expressão de anticorpos na superfície, a produtividade específica variou de 50 a 70 picogramas por célula por dia.Em contraste, a produtividade de anticorpos foi de aproximadamente 20 picogramas por célula por dia para os dois melhores clones gerados a partir da população celular com baixa expressão de anticorpos na superfície. Além disso, linhagens celulares desenvolvidas por triagem por fatores são mais estáveis em relação à produção de anticorpos do que aquelas clonadas por diluição limitante manual. A produtividade específica do melhor clone, o clone um, gerado por diluição limitante manual, caiu de aproximadamente 30 PCD para cerca de 10 PCD após o cultivo por 80 duplicações celulares.Por outro lado, o subclone superior gerado pela clonagem por ordenação por fax foi capaz de manter a produtividade específica em torno de 20 PCD por pelo menos 100 duplicações celulares. A identificação do local de integração do transgene no cromossomo celular por hibridização in situ fluorescente demonstrou que o clone um é uma população mista de fenótipo A e fenótipo B. Em contraste, o clone ordenado por fax pareceu ser uma população mais homogênea, com 99,5% das células apresentando o fenótipo A. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como desenvolver linhagens celulares para produção de proteínas terapêuticas.

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Na era pós-genômica humana, a disponibilidade de proteínas recombinantes em conformações nativas é crucial para a investigação estrutural, funcional e terapêutico e desenvolvimento. Aqui, nós descrevemos um-teste e em grande escala sistema de expressão de proteínas em células humanas embrionárias de rim 293T que podem ser utilizados para produzir uma variedade de proteínas recombinantes.

A Plataforma de expressão adequada e geral para a produção de proteínas secretadas a partir de células humanas

Nós desenvolvemos uma cultura de células automatizado e uma plataforma de interrogação para experiências de estimulação de células micro-escala. A plataforma oferece um controle simples, versátil e preciso para cultivar e estimular pequenas populações de células e recuperar lisados ​​para análises moleculares. A plataforma é bem adequado para os estudos que utilizam células preciosos e / ou reagentes.

A plataforma automatizada versátil para experiências de estimulação Micro escala celulares

Os protocolos descritos permitem que os laboratórios realizem cultura de células-tronco escaláveis e aderentes em alto rendimento com mão de obra, experiência e custo mínimo de investimento em equipamentos usando um robô programável de manuseio de líquidos e placas de 96 poços.  As iPSCs passadas mais de 20 vezes neste sistema mantiveram a pluripotência, cariótipos normais e se diferenciaram em cardiomiócitos.

Escalável placa de 96 poços Baseado iPSC Cultura e Produção Usando um sistema de manipulação robótica Líquido

É apresentado um protocolo detalhado para a operação simultânea de 48 culturas de pilha paralela em variadas condições em um sistema de microbioreactor. Processo de cultura de células, colheita e análise de título de anticorpos subsequentes são descritos.

Uso do elevado-Throughput Microbioreactor sistema automatizado para produção de IgG1 modelo em células CHO

A automação é fundamental para aumentar o dimensionamento e o gerenciamento de custos na fabricação de células. Este manuscrito descreve o uso de um dispositivo de processamento de células centrífugas de contrafluxo para automatizar as etapas de troca de buffer e concentração de células para o bioprocessamento em pequena escala.

Sistema centrífuga de contrafluxo automatizado para processamento de células em pequena escala

Mostramos a automação das culturas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSC) e diferenciações neuronais compatíveis com imagens e análises automatizadas.

Produção automatizada de neurônios cortical e dopaminérgico derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos com monitoramento integrado de células vivas

Aqui, apresentamos um protocolo para alcançar a fabricação em larga escala de células aderentes através de um sistema totalmente fechado baseado em microcarreadores dissolvidos grau GMP. O cultivo de células-tronco mesenquimais humanas, células HEK293T e células Vero foi validado e atendeu tanto às exigências de quantidade quanto aos critérios de qualidade para a indústria de terapia celular e gênica.

Produção de células em larga escala com base em microtransportadores porosos solúveis de grau GMP

Este artigo detalha o processo de fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico para uso clínico, especificamente usando um processador de células automatizado capaz de realizar transdução viral e cultivo de células T. Fornecemos recomendações e descrevemos armadilhas que devem ser consideradas durante o processo de desenvolvimento e implementação de um ensaio clínico de fase inicial.

Fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico em um processador de células automatizado

Este protocolo documenta a fabricação e montagem do SPOT, uma plataforma de cultura baseada em andaimes de alto rendimento, nos formatos de 96 e 384 poços. Ele também detalha o processo de semeadura do SPOT, tanto manual quanto usando um manipulador de líquidos disponível comercialmente.

Fabricação reprodutível de SPOT como uma plataforma de cultura baseada em andaimes de alto rendimento

Este protocolo descreve um método escalável para a expansão de produtos de Terapias Celulares Adotivas (ACT), nomeadamente células T do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR)-T e células Killer Induzidas por Citocinas (CIK), utilizando dispositivos de expansão rápida permeável a gases (G-Rex), demonstrando crescimento eficiente e robusto em um ambiente clinicamente relevante.

Geração Eficiente e Rápida de Células Assassinas Induzidas por CAR-T e Citocinas em Dispositivos Escaláveis por GMP

Aprenda a desenvolver linhagens celulares automatizadas para produção de proteínas terapêuticas usando citometria de fluxo e imagem de colônias. Este método melhora a produtividade e estabilidade das células.

Uma plataforma de alta capacidade automatizada para o Desenvolvimento de linhagens celulares para a fabricação de proteínas Therapeutics (Vídeo) | JoVE Journal

Uma plataforma de alta capacidade automatizada para o Desenvolvimento de linhagens celulares para a fabricação de proteínas Therapeutics

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