Extração de exossomos baseada em esferas magnéticas: uma técnica para isolar exossomos específicos de biofluidos

Os exossomos são estruturas vesiculares extracelulares secretadas pelas células em biofluidos. Para capturar exossomos específicos de biofluidos, comece tomando esferas magnéticas revestidas de estreptavidina em um tubo.

A este tubo, adicione anticorpos anti-humanos biotinilados. A biotina presente nos anticorpos tem uma alta afinidade pela estreptavidina presente nas esferas magnéticas. Isso resulta na conjugação dos anticorpos com as esferas magnéticas.

Em seguida, adicione uma solução de bloqueio rica em proteínas ao tubo que contém as esferas magnéticas marcadas com anticorpos. As proteínas na solução de bloqueio se ligam aos locais livres nas esferas magnéticas e aumentam a especificidade da ligação do exossomo.

Agora, complemente o tubo com uma amostra de biofluido rico em exossomos. Incubar o tubo com agitação. Os exossomos no biofluido exibem receptores de superfície específicos, que os ajudam a se ligar aos anticorpos ligados à superfície das esferas magnéticas.

Em seguida, coloque o tubo em um campo magnético. Sob a influência do campo magnético, os grânulos magnéticos ligados ao exossomo se ligam à superfície do tubo. Em seguida, usando uma micropipeta, aspire o biofluido restante do tubo.

Finalmente, remova o tubo do campo magnético e adicione um tampão adequado para eluir as esferas ligadas ao exossomo. Esses grânulos ligados ao exossomo podem ser usados para análises posteriores a jusante.

Ressuspenda uma solução estoque contendo 10 microgramas por mililitro de micropartículas magnéticas revestidas com estreptavidina e adicione 5 microlitros da solução a um tubo de microcentrífuga contendo 495 microlitros de PBS. Para lavar as contas, primeiro coloque o tubo em um rack magnético por 1 minuto e remova cuidadosamente o tampão sem mexer nas contas.

Em seguida, transfira o tubo para um rack não magnético. Adicione 500 microlitros de PBS e pipeta para lavar as contas. Faça isso um total de três vezes. Após a lavagem final, ressuspenda as esferas em 490 microlitros de PBS e, em seguida, adicione 5 microlitros de anticorpo anti-CD63 humano de camundongo biotinilado a partir de uma solução estoque de 1 miligrama por mililitro.

Misturar a solução pipetando. Programe um rotador de amostra para rotação recíproca a 90 graus por 5 segundos e vibração a 5 graus por 1 segundo. Coloque os tubos no rotador e execute o programa por 30 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, transfira os tubos para o rack magnético por 5 minutos. Lave as esferas três vezes com 500 microlitros de PBS e depois ressuspenda-as em 490 microlitros de PBS contendo caseína. Rotule um tubo com a identificação da amostra e adicione 10 microlitros da amostra.

Pipetar várias vezes para misturar a amostra com as esferas conjugadas com anticorpos. Em seguida, transfira os tubos para o rotador de amostra e execute o mesmo programa por 2 horas em temperatura ambiente. Em seguida, lave as esferas três vezes com 500 microlitros de um tampão de triscloridrato 1M usando o rack magnetizado. Os exossomos agora estão ligados às esferas magnetizadas.