Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 3:17 min. • April 30th, 2023
As células-tronco do glioma ou GSCs são uma subpopulação de glioma - um câncer de células gliais no cérebro.
A marcação dessas GSCs com enzimas bioluminescentes como a luciferase ajuda a estabelecer ensaios de imagem de alto rendimento para triagem de drogas.
Para preparar GSCs marcados com luciferase, comece com uma cultura de GSCs em um meio de crescimento adequado.
Centrifugue a cultura para obter um pellet celular e remova o sobrenadante.
Adicione enzimas digestivas adequadas ao pellet. Essas enzimas dissociam aglomerados de células e degradam quaisquer vestígios de tecido conjuntivo para obter uma suspensão unicelular.
Agora, centrifugue a suspensão de célula única e remova o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em um meio fresco.
Em seguida, semeie a concentração desejada de células em uma placa de cultura.
Incube a cultura e permita que as células adiram à placa de cultura.
Posteriormente, adicione o título desejado de uma construção de gene contendo vírus para proteína fluorescente verde aprimorada com luciferase ou EGFP e incube.
O vírus interage com os receptores de superfície das GSCs, desencadeando a liberação de RNA viral contendo luciferase-EGFP. As enzimas celulares catalisam a transcrição reversa do RNA para o DNA de fita dupla e o integram ao genoma das GSCs.
Quando visualizadas sob um microscópio de fluorescência, as células que expressam luciferase aparecem verdes devido à fluorescência emitida pelo EGFP.
Comece coletando as células-tronco de glioma ou GSCs do meio de cultura e centrifugando-as a 70 x g por 3 minutos em temperatura ambiente. Depois de remover o sobrenadante, digerir as células com accutase por 4 minutos a 37 graus Celsius.
Usando uma ponta de 200 microlitros, pipete as células repetidamente para dissociar e ressuspender o pellet celular. Adicione os GSCs a uma densidade de 200.000 células em 1 mililitro de meio de cultura em cada poço de uma placa de cultura de 12 poços e incube-os durante a noite.
No dia seguinte, adicione 30 microlitros de sobrenadante do vírus luciferase-EGFP em cada poço da placa. Centrifugue as células a 1.000 x g por 2 horas a 25 graus Celsius e incube-as durante a noite.
No dia seguinte, recoloque o meio nos poços coletando os GSCs, centrifugando-os, removendo o sobrenadante, ressuspendendo-os em meio fresco e replaqueando-os. Cultive as células por mais 48 horas.
Observe a placa sob um microscópio fluorescente e confirme o aparecimento de células GFP-positivas.