Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 3:17 min. • April 30th, 2023
A bioluminescência celular é uma abordagem altamente sensível e rápida para a triagem em larga escala de medicamentos anticâncer.
Essa técnica usa células tumorais que expressam luciferase - uma enzima que catalisa uma reação química produtora de luz, fazendo com que as células hospedeiras brilhem no escuro. A intensidade da luminescência emitida é diretamente proporcional à densidade de células vivas.
Para começar, semeie as células que expressam luciferase em uma placa de cultura opticamente transparente revestida com uma matriz extracelular ou ECM e incuba.
Durante a incubação, a ECM promove a fixação das células ao poço de cultura.
Em seguida, pegue estoques concentrados da combinação de medicamentos e adicione diferentes volumes de meios de cultura para preparar a diluição em série da mistura de medicamentos.
Agora, remova o meio de cultura das células aderidas. Adicione diferentes diluições da combinação de medicamentos e incube.
Durante a incubação, a combinação de medicamentos atua sinergicamente nos alvos celulares.
Agora, remova o meio que contém o medicamento e adicione o meio fresco contendo luciferina.
A luciferina se difunde através da membrana e entra nas células. As luciferases expressas pelas células usam ATP celular para oxidar a luciferina e emitir sinais luminosos.
Quantifique a bioluminescência celular sob um sistema de imagem.
Uma diminuição na emissão de luz com o aumento da concentração do medicamento indica viabilidade celular reduzida. Isso se correlaciona com o efeito antiproliferativo da droga nas células-alvo.
Cubra as placas de fundo óptico de 96 poços com uma mistura de matriz extracelular, como Matrigel, e incube-as por 1 hora a 37 graus Celsius. Remova o excesso da mistura e enxágue suavemente as placas uma vez com PBS.
Em seguida, semeie células XG387-Luc a uma densidade de 1.000 células em 100 microlitros de meio de cultura em cada poço das placas revestidas e cultive-as durante a noite. No dia seguinte, observe as células ao microscópio para confirmar sua fixação à placa.
Em seguida, prepare uma solução de temozolomida de 200 micromolares e soluções de 2 micromolares dos agentes alvo em meio de cultura. Para triagem combinada de medicamentos, remova o meio em branco e adicione o meio contendo temozolomida 200 micromolar ou agente direcionado 2 micromolar, ou uma combinação de ambos, em cada poço para 3 réplicas técnicas por tratamento.
Incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 3 dias. Tire imagens da bioluminescência celular na placa usando o sistema de imagem de espectro IVIS. Usando o software integrado, crie várias áreas circulares da região de interesse e quantifique a bioluminescência celular.