Purificação de Núcleos Baseada em Centrifugação de Gradiente: Uma Técnica para Obter Fração Ultrapura de Núcleos Intactos Usando Centrifugação de Gradiente de Densidade

Para isolar e purificar núcleos intactos, comece tomando uma fração bruta de núcleos em um tubo. A fração contém núcleos intactos, juntamente com fragmentos de núcleos quebrados e detritos.

Misturar esta fracção com um meio de gradiente de densidade adequado, de modo a formar uma suspensão da concentração mais baixa.

Agora, soluções de camadas de densidades crescentes do mesmo meio de gradiente abaixo da fração de núcleos brutos pré-preparada para gerar um gradiente de densidade descontínuo de várias etapas. Esta etapa permite que a fração de núcleos brutos forme uma banda no topo do gradiente.

Em seguida, centrifugue o tubo em baixa velocidade.

Com base nas diferenças de forma e massa, os núcleos intactos migram de maneira diferente em comparação com detritos e fragmentos nucleares. Isso resulta em núcleos intactos formando uma banda separada.

Após a centrifugação, localize a banda distinta que consiste em núcleos intactos na interface das soluções de gradiente de densidade.

Usando uma pipeta, aspire as camadas superiores do gradiente para facilitar o acesso à banda de núcleos puros. Recolher a banda que contém os núcleos num novo tubo.

Visualize esses núcleos sob um microscópio de luz. Os núcleos intactos parecem perfeitamente redondos com uma membrana nuclear intacta ao seu redor.

Finalmente, armazene a fração nuclear pura para análise posterior.

Adicione 200 microlitros de solução de iodixanol a 50% aos núcleos para uma concentração final de 25% de iodixanol e misture 10 vezes com a pipeta ajustada para 300 microlitros.

Em seguida, adicione 300 microlitros de solução de iodixanol a 29% sob a mistura a 25% usando uma ponta fina P1000 para evitar misturar as camadas. Adicione 300 microlitros de solução de iodixanol a 35% sob a mistura de 29% com uma ponta fina P1000. Em seguida, remova-o lentamente.

Coloque as amostras em uma centrífuga de balde oscilante e gire-as por 20 minutos a 3.500 x g a 4 graus Celsius com o freio desligado.

Remova cuidadosamente as amostras sem agitar e observe-as sob a luz. Uma faixa branca clara de núcleos 95% puros deve ser visível entre a segunda e a terceira camada.

Para isolar os núcleos, aspire as camadas superiores para expor a banda branca dos núcleos na interface. Colete a banda de núcleos em um volume de 200 mililitros e transfira-a para um novo tubo. Em seguida, filtre-o com um filtro de 20 micrômetros.

Verifique os núcleos sob um microscópio óptico para verificar a remoção de grandes detritos e a integridade da membrana nuclear. Eles devem ser redondos e a membrana nuclear não deve ser distorcida.