JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 2:37 min • April 30th, 2023
Para criopreservar uma amostra de cérebro murino por congelamento, comece pegando um béquer cheio de solução de isopentano - um líquido altamente condutor - e mergulhe-o em um frasco contendo nitrogênio líquido.
Congele o isopentano até que a solução fique viscosa.
Enquanto isso, pegue uma amostra inteira do cérebro do camundongo prefixada em solução de sacarose. Este tratamento evita a deformação do tecido cerebral nas etapas subsequentes.
Remova a amostra de cérebro da solução de sacarose e seque-a para remover quaisquer vestígios de sacarose.
Em seguida, posicione o cérebro na orientação desejada em um criomold profundo contendo uma camada de meio de incorporação.
Sobreponha o cérebro no criomold com mais meios de incorporação para garantir que todo o órgão seja coberto.
Em seguida, mergulhe o criomold contendo o cérebro embutido no banho de isopentano pré-resfriado. O rápido resfriamento do tecido cerebral a uma temperatura ultrabaixa garante a retenção da arquitetura cerebral sem qualquer distorção.
Agora, deixe a amostra do cérebro congelar até que o meio de incorporação solidifique formando uma camada gelatinosa ao redor do cérebro, mantendo-o no lugar.
Depois de congelado, remova o criomold do banho de isopentano e envolva o cérebro do camundongo criopreservado em uma folha de alumínio.
Armazene a amostra a oitenta graus Celsius negativos para análise histológica adicional.
Para se preparar para a criopreservação, encha um frasco com isopentano/2-metilbutano frio e coloque o frasco em um recipiente cheio de nitrogênio líquido. Enquanto o solvente está esfriando, seque o cérebro em um pedaço de papel de filtro e coloque o cérebro em um criomolde rotulado.
Adicione cuidadosamente aproximadamente 5 mililitros de meio de corte de temperatura ideal ao centro do criomold e coloque o cérebro no molde na orientação desejada. Usando uma pinça limpa, coloque rapidamente o criomold no isopentano/2-metilbutano resfriado por 30 a 40 segundos.
Assim que o meio de corte solidificar, transfira o criomold para gelo seco e envolva o criomold e o tecido cerebral congelado em papel alumínio para armazenamento de 80 graus Celsius negativos.