Extração baseada em imunoafinidade de peptídeos ubiquitinilados: uma técnica para extrair seletivamente peptídeos marcados com ubiquitina de frações peptídicas purificadas

0 vistas4:00 min • April 30th, 2023

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A ubiquitinação de proteínas é caracterizada pela adição de ubiquitina - uma miniproteína reguladora - por meio de seus resíduos de diglicina aos resíduos de lisina da proteína substrato. Isso gera uma ligação lisina-glicina-glicina entre a proteína substrato e a ubiquitina.

Para isolar peptídeos marcados com ubiquitina, comece tomando uma mistura de peptídeos.

Trate esses peptídeos com um coquetel de enzimas endonuclease. Durante o tratamento, as enzimas Lys-C e tripsina clivam eficientemente os peptídeos ubiquitinilados no resíduo de arginina, resultando em fragmentos de peptídeos contendo um motivo de diglicina característico.

Adicione esses fragmentos de peptídeos a uma pasta de esferas de hidrogel conjugadas com anticorpos.

Esses anticorpos contêm um sítio de reconhecimento de diglicina, que se liga exclusivamente aos peptídeos ubiquitinilados, formando um complexo peptídeo-grânulo.

Centrifugar para peletizar complexos peptídeo-grânulos ubiquitinilados. Remova o sobrenadante contendo peptídeo não ubiquitinilado não ligado.

Carregue os complexos em um conjunto de filtro. Centrifugue para remover o tampão e reter os grânulos conjugados com peptídeos.

Adicione um reagente acidificado que reduz o pH, causando o desprendimento dos peptídeos das contas.

Recupere os peptídeos livres do filtrado. Carregue-os em um filtro novo com uma matriz hidrofóbica. Os peptídeos retêm na matriz enquanto os sais ácidos são lavados.

Usando um solvente adequado, retire os peptídeos.

Transfira os peptídeos ubiquitinilados para um tubo novo e seque-os para remover quaisquer vestígios de solvente.

Um lote de anticorpos de motivo remanescente de ubiquitina conjugados à pasta de grânulos de agarose da proteína A é dividido em seis frações iguais. Dissolva as três frações peptídicas de acordo com as instruções do manuscrito e gire os detritos.

Adicione os sobrenadantes das três frações à pasta de grânulos, mantendo as outras três frações no gelo e incube-as por 2 horas a 4 graus Celsius em uma unidade rotativa.

Em seguida, gire as contas. Transfira o sobrenadante para um novo lote de esferas e repita a incubação com as três frações restantes de pasta de contas.

Armazene os sobrenadantes para análise subsequente do proteoma global e transfira os grânulos para pontas de pipeta de 200 microlitros equipadas com um plugue de filtro GF/F.

Coloque as pontas em tubos de 1,5 mililitro equipados com um adaptador de ponta de centrífuga e lave as esferas três vezes com 200 microlitros de tampão IAP gelado, seguido de três lavagens com água purificada gelada.

Gire as colunas a 200 x g por 2 minutos entre as lavagens, certificando-se de não deixar a coluna secar. Após a lavagem final, eluir os peptídeos com dois ciclos de 50 microlitros de 0,15% de TFA. Dessalinize os peptídeos com uma ponta de estágio C18 e seque-os com centrifugação a vácuo.

10:50

Isolamento de proteínas lábeis Multi-Complexos por In vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Imuno-magnética cromatografia de afinidade

Vídeos relacionados

0 Visualizações

07:28

Enriquecimento de Proteínas da Matriz Extracelular a partir de tecidos e digestão em péptidos para Análise de Espectrometria de Massa

Vídeos relacionados

0 Visualizações

09:03

Caracterização de proteínas celulares com oxidação fotoquímica rápida de proteínas

Vídeos relacionados

0 Visualizações

09:00

Detecção de Ubiquitinação Protein

Vídeos relacionados

0 Visualizações

06:09

Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

Vídeos relacionados

0 Visualizações

10:37

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Vídeos relacionados

0 Visualizações

08:12

Utilizando um sistema de enriquecimento de imunoprecipitação abrangente para identificar um perfil endógena modificação pós-traducional de proteínas alvo

Vídeos relacionados

0 Visualizações

11:54

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

Vídeos relacionados

0 Visualizações

10:26

Perfil de Ubiquitin e Ubiquitin-like Modificações pós-translacionais dependentes e identificação de alterações significativas

Vídeos relacionados

0 Visualizações

08:33

Análise da cadeia de Ubiquitin por monitoramento de reação paralela

Vídeos relacionados

0 Visualizações

Última atualização: 1 agosto 2026