Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 4:00 min. • April 30th, 2023
A ubiquitinação de proteínas é caracterizada pela adição de ubiquitina - uma miniproteína reguladora - por meio de seus resíduos de diglicina aos resíduos de lisina da proteína substrato. Isso gera uma ligação lisina-glicina-glicina entre a proteína substrato e a ubiquitina.
Para isolar peptídeos marcados com ubiquitina, comece tomando uma mistura de peptídeos.
Trate esses peptídeos com um coquetel de enzimas endonuclease. Durante o tratamento, as enzimas Lys-C e tripsina clivam eficientemente os peptídeos ubiquitinilados no resíduo de arginina, resultando em fragmentos de peptídeos contendo um motivo de diglicina característico.
Adicione esses fragmentos de peptídeos a uma pasta de esferas de hidrogel conjugadas com anticorpos.
Esses anticorpos contêm um sítio de reconhecimento de diglicina, que se liga exclusivamente aos peptídeos ubiquitinilados, formando um complexo peptídeo-grânulo.
Centrifugar para peletizar complexos peptídeo-grânulos ubiquitinilados. Remova o sobrenadante contendo peptídeo não ubiquitinilado não ligado.
Carregue os complexos em um conjunto de filtro. Centrifugue para remover o tampão e reter os grânulos conjugados com peptídeos.
Adicione um reagente acidifi
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