Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 4:00 min. • April 30th, 2023
A ubiquitinação de proteínas é caracterizada pela adição de ubiquitina - uma miniproteína reguladora - por meio de seus resíduos de diglicina aos resíduos de lisina da proteína substrato. Isso gera uma ligação lisina-glicina-glicina entre a proteína substrato e a ubiquitina.
Para isolar peptídeos marcados com ubiquitina, comece tomando uma mistura de peptídeos.
Trate esses peptídeos com um coquetel de enzimas endonuclease. Durante o tratamento, as enzimas Lys-C e tripsina clivam eficientemente os peptídeos ubiquitinilados no resíduo de arginina, resultando em fragmentos de peptídeos contendo um motivo de diglicina característico.
Adicione esses fragmentos de peptídeos a uma pasta de esferas de hidrogel conjugadas com anticorpos.
Esses anticorpos contêm um sítio de reconhecimento de diglicina, que se liga exclusivamente aos peptídeos ubiquitinilados, formando um complexo peptídeo-grânulo.
Centrifugar para peletizar complexos peptídeo-grânulos ubiquitinilados. Remova o sobrenadante contendo peptídeo não ubiquitinilado não ligado.
Carregue os complexos em um conjunto de filtro. Centrifugue para remover o tampão e reter os grânulos conjugados com peptídeos.
Adicione um reagente acidificado que reduz o pH, causando o desprendimento dos peptídeos das contas.
Recupere os peptídeos livres do filtrado. Carregue-os em um filtro novo com uma matriz hidrofóbica. Os peptídeos retêm na matriz enquanto os sais ácidos são lavados.
Usando um solvente adequado, retire os peptídeos.
Transfira os peptídeos ubiquitinilados para um tubo novo e seque-os para remover quaisquer vestígios de solvente.
Um lote de anticorpos de motivo remanescente de ubiquitina conjugados à pasta de grânulos de agarose da proteína A é dividido em seis frações iguais. Dissolva as três frações peptídicas de acordo com as instruções do manuscrito e gire os detritos.
Adicione os sobrenadantes das três frações à pasta de grânulos, mantendo as outras três frações no gelo e incube-as por 2 horas a 4 graus Celsius em uma unidade rotativa.
Em seguida, gire as contas. Transfira o sobrenadante para um novo lote de esferas e repita a incubação com as três frações restantes de pasta de contas.
Armazene os sobrenadantes para análise subsequente do proteoma global e transfira os grânulos para pontas de pipeta de 200 microlitros equipadas com um plugue de filtro GF/F.
Coloque as pontas em tubos de 1,5 mililitro equipados com um adaptador de ponta de centrífuga e lave as esferas três vezes com 200 microlitros de tampão IAP gelado, seguido de três lavagens com água purificada gelada.
Gire as colunas a 200 x g por 2 minutos entre as lavagens, certificando-se de não deixar a coluna secar. Após a lavagem final, eluir os peptídeos com dois ciclos de 50 microlitros de 0,15% de TFA. Dessalinize os peptídeos com uma ponta de estágio C18 e seque-os com centrifugação a vácuo.