Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 3:22 min. • April 30th, 2023
Para começar, pegue um tubo contendo vesículas extracelulares intactas ou EVs.
Suspenda os EVs no volume desejado de tampão de lise e sonice a amostra. Este tratamento lisa a membrana EV e corta o material genético, liberando as proteínas no tampão.
Centrifugue para peletizar os detritos celulares e o material genético cortado. Colete o sobrenadante contendo várias proteínas.
Adicione um corante de carga ao extrato de proteína e execute-o em um gel SDS-PAGE.
Mergulhe o gel em uma solução de coloração para permitir que as moléculas do corante se liguem às proteínas. Localize a faixa corada contendo a proteína desejada e retire-a.
Corte a faixa colorida em pedaços pequenos para melhorar a acessibilidade das proteínas às enzimas nas etapas subsequentes. Transfira essas peças para um tubo de microcentrífuga.
Adicione uma solução descolorante que remova o corante de coloração. Remova a solução de descoloração gasta.
Adicione uma solução de redução. Incubar para permitir que o agente redutor clive as ligações dissulfeto na proteína, expondo os grupos sulfidrila livres.
Trate as proteínas reduzidas com uma solução alquilante. Os grupos alquila se ligam aos grupos sulfidrila livres, mantendo a proteína desdobrada.
Descarte o excesso de solução e lave as peças com uma solução desidratante para remover o reagente alquilante. Seque o gel completamente.
As peças de gel estão agora prontas para análises proteômicas adicionais.
Para extração de proteínas, misture 50 microlitros de tampão RIPA com a amostra EV por 5 minutos no gelo. Sonicar a amostra três vezes a 500 watts e 20 quilohertz durante 5 segundos. Em seguida, remova os detritos vesiculares centrifugando a 20.000 x g por 10 minutos a 4 graus Celsius.
Após isolar as proteínas, realizar a migração de proteínas no gel de empilhamento de um gel de poliacrilamida a 12%. Fixe as proteínas no gel com azul de Coomassie por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, retire cada pedaço de gel colorido e corte-o em pedaços pequenos.
Submeta os pedaços de gel a uma série de lavagens sucessivas, conforme descrito no manuscrito. Em seguida, seque-os completamente com um concentrador a vácuo. Após a secagem, realize a redução de proteínas com 100 microlitros de bicarbonato de amônio 100 milimolares contendo ditiotreitol 10 milimolares por 1 hora a 56 graus Celsius.
Em seguida, execute a alquilação de proteínas com 100 microlitros de bicarbonato de amônio 100 milimolares contendo iodoacetamida 50 milimolares por 45 minutos no escuro. Lave os pedaços de gel de acordo com as instruções do manuscrito e seque-os completamente no concentrador a vácuo.