Extração baseada em SDS-PAGE de proteínas associadas a vesículas extracelulares: um procedimento para extrair proteínas de EVs e prepará-las para digestão em gel

Para começar, pegue um tubo contendo vesículas extracelulares intactas ou EVs.

Suspenda os EVs no volume desejado de tampão de lise e sonice a amostra. Este tratamento lisa a membrana EV e corta o material genético, liberando as proteínas no tampão.

Centrifugue para peletizar os detritos celulares e o material genético cortado. Colete o sobrenadante contendo várias proteínas.

Adicione um corante de carga ao extrato de proteína e execute-o em um gel SDS-PAGE.

Mergulhe o gel em uma solução de coloração para permitir que as moléculas do corante se liguem às proteínas. Localize a faixa corada contendo a proteína desejada e retire-a.

Corte a faixa colorida em pedaços pequenos para melhorar a acessibilidade das proteínas às enzimas nas etapas subsequentes. Transfira essas peças para um tubo de microcentrífuga.

Adicione uma solução descolorante que remova o corante de coloração. Remova a solução de descoloração gasta.

Adicione uma solução de redução. Incubar para permitir que o agente redutor clive as ligações dissulfeto na proteína, expondo os grupos sulfidrila livres.

Trate as proteínas reduzidas com uma solução alquilante. Os grupos alquila se ligam aos grupos sulfidrila livres, manten