Ensaio de atração de macrófagos transwell baseado em fluorescência: um método in vitro para estudar a interação tumor-macrófago por meio de quimiotaxia induzida por produtos químicos

Em resposta a certos atrativos químicos liberados por tumores sólidos, células imunes, como macrófagos associados a tumores ou TAMs, infiltram-se nos tumores sólidos. Posteriormente, esses TAMs facilitam a progressão do tumor.

Para estudar as interações entre TAMs e células tumorais in vitro, comece pegando uma placa multipoços com uma inserção membranosa. Este arranjo separa temporariamente o poço em dois compartimentos.

Em seguida, adicione uma suspensão de TAMs ao compartimento superior do transpoço.

Suplementar o compartimento inferior do poço trans com um meio condicionado enriquecido com atrativos químicos secretados pelas células tumorais.

Incube a placa pelo tempo desejado.

Durante a incubação, os moduladores químicos atraem TAMs. Isso leva ao movimento de TAMs para o compartimento inferior através da membrana de inserção porosa por meio de quimiotaxia induzida por produtos químicos.

Agora, remova a inserção do poço. Transfira o meio condicionado contendo a população migrante de TAM para uma placa adequada para medição fluorescente.

Trate as células com um tampão de lise contendo corante fluorescente. Este tampão lisa os macrófagos. Eventualmente, as moléculas de corante se ligam aos ácidos nucléicos, produzindo uma fluorescência aprimorada.

Finalmente, escaneie a placa usando um leitor de placa de fluorescência. Uma alta fluorescência indica a migração bem-sucedida de macrófagos por meio de quimiotaxia induzida por produtos químicos.

Primeiro, leve os materiais necessários à temperatura ambiente. Adicione 250 microlitros das células MV-4-11 preparadas a cada inserção. Em seguida, adicione 400 microlitros do meio/meio condicionado apenas às câmaras inferiores da placa de 24 poços, certificando-se de adicionar as amostras em triplicata.

Incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 4 horas. Em seguida, bata suavemente na inserção na parede interna do mesmo poço e descarte a inserção. Pipete suavemente as células dos poços para cima e para baixo três vezes para misturar.

Transfira 225 microlitros desta suspensão de células para os poços de uma placa de 96 poços de parede preta adequada para medição fluorescente. Depois disso, dilua o corante CyQuant com tampão de lise 4x na proporção de 1:75. Vortex brevemente e gire a solução.

Transfira 75 microlitros desta solução para cada poço da placa de 96 poços e incube em temperatura ambiente por 15 minutos. Usando um leitor de placa de fluorescência, leia a fluorescência e analise os dados conforme descrito no protocolo de texto.