Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 2:54 min. • April 30th, 2023
Comece pegando uma placa de vários poços contendo células aderentes.
Trate essas células com um meio contendo timidina tritiada - uma versão radioativa da timidina - e incuba.
Durante a incubação, as células que se replicam ativamente incorporam timidina radioativa. Esta timidina emparelha a adenosina oposta, gerando DNA radiomarcado em células em proliferação.
Remova a mídia gasta dos poços. Adicione um tampão de lise para lisar as células e liberar DNA na suspensão.
Prepare o conjunto do coletor de células colocando os tubos coletores do coletor sobre os poços da microplaca.
Aplique pressão de sucção para permitir a aspiração de DNA suspenso dos poços. Esse DNA se deposita no papel de filtro, formando manchas específicas.
Recorte os chads de papel de filtro com manchas de DNA. Transfira esses chads individualmente para frascos de cintilação.
Cubra o papel de filtro com um coquetel de cintilação. Coloque o frasco para injetáveis num contador de cintilação líquida.
Dentro do balcão, o DNA marcado emite energia por decaimento radioativo. Essa energia é absorvida pelos componentes do coquetel de cintilação. Eventualmente, os componentes do coquetel começam a transferir os pulsos, que por sua vez são absorvidos pelo sensor.
A quantidade de radioatividade detectada determina a extensão da divisão celular.
Placa de 100.000 células em poços triplicados em uma placa de 24 poços. Após 46 horas, adicione timidina tritiada ao meio de cultura e incube a 37 graus Celsius por 2 horas.
Em seguida, após remover o meio, adicione 300 microlitros de tripsina-EDTA a 0,25% pré-aquecido e incube por 20 minutos a 37 graus Celsius para separar as células e liberar o DNA. Em seguida, ligue o coletor de células e ligue.
Coloque o papel de filtro no coletor de células. Continue coletando os tubos do coletor de células em uma bandeja vazia em branco. Em seguida, pressione a pré-lavagem para molhar o papel de filtro. Coloque os tubos coletores em poços de amostra e comece.
Use uma fonte de luz quente para secar o papel de filtro e arrume os frascos correspondentes na bandeja. Perfure chads de papel nos frascos e, em seguida, adicione 2 mililitros de coquetel de cintilação líquida a cada frasco.
Incube os frascos por 1 hora no contador de cintilação antes de operar a máquina para obter as contagens por minuto de cada amostra, que reflete a síntese de DNA ativo.