Ensaio de Neuroesfera NPC: Um Ensaio In Vitro para Avaliar a Resposta Migratória de Células Precursoras Neurais da Neuroesfera

As neuroesferas são agregados esféricos não aderentes de células precursoras neurais ou NPCs.

Quando plaqueados sob condições específicas de cultura aderente, os NPCs podem migrar espontaneamente para fora da neuroesfera.

Para avaliar a resposta migratória dos NPCs, primeiro, prepare uma suspensão de NPC da densidade desejada em um meio adequado.

Em seguida, semeie a suspensão celular em uma placa de cultura contendo meio e incuba.

Os fatores de crescimento específicos no meio suportam a proliferação de células. Além disso, a ausência de um substrato de revestimento mantém as células suspensas no meio, facilitando a formação de agregados de células 3D chamados neuroesferas.

Ao atingir o tamanho desejado, colete as neuroesferas.

Centrifugue e ressuspenda o pellet da neuroesfera no meio diluído.

Em seguida, coloque a suspensão da neuroesfera em uma placa revestida com matriz extracelular contendo meio diluído e incuba.

Durante a cultura, as neuroesferas aderem à matriz extracelular.

Com o tempo, devido aos constituintes da matriz extracelular, alguns NPCs começam a migrar para longe do núcleo da neuroesfera.

Agora, remova a mídia e conserte as células.

Capture imagens de contraste de fase das neuroesferas que exibem migração celular.

Usando um software adequado, meça a área da neuroesfera total e a massa celular interna.

Finalmente, subtraia a área de massa celular interna da área total da neuroesfera para calcular a migração média de NPC da neuroesfera.

Para formar a neuroesfera, pipete 1 mililitro de meio de expansão 100% em um prato de 35 milímetros sem nenhum substrato de revestimento. Em seguida, adicione um milhão de células precursoras neurais em cada uma dessas placas e incube a placa a 37 graus Celsius por 48 a 96 horas.

Para preparar a placa para a migração da neuroesfera, dissolva alíquotas de gel que imitam ECM em 6 mililitros de meio de expansão a 30%. Adicione 1 mililitro de gel imitador de ECM com 30% de meio de expansão em um único poço de uma placa de 6 poços. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Para colocar as neuroesferas em placas, use uma pipeta para coletar as células do meio do prato de 35 milímetros e transferi-las para um tubo cônico. Em seguida, gire o tubo a 100 x g para peletar as neuroesferas. Em seguida, ressuspenda o pellet em 1 a 3 mililitros de meio de expansão a 30% pré-aquecido.

Em seguida, pipete 200 microlitros das neuroesferas ressuspensas na placa de 6 poços contendo o gel imitador de ECM com meio de expansão de 30% e balance a placa. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por 48 horas. Aspire o gel imitador de ECM com meio de expansão a 30% e, em seguida, fixe as células por 30 minutos usando paraformaldeído a 4%.

Para analisar as neuroesferas, capture imagens usando configurações de contraste de fase com ampliação de 10X. Use o software NIH ImageJ para medir a migração média das neuroesferas. No ImageJ, use a ferramenta de linha à mão livre para traçar o contorno externo da neuroesfera.

Em seguida, use a função de medida para calcular a área de rastreamento e rastrear a massa celular interna da esfera. Subtraia a massa celular interna da área total da neuroesfera para quantificar a migração média.