Isolamento de astrócitos: um método para obter preparação pura de astrócitos corticais de camundongos

A cultura in vitro de astrócitos ajuda a investigar o papel biológico dos astrócitos - as células cerebrais mais abundantes.

Comece com um cérebro de camundongo neonatal colocado sob um microscópio de dissecação.

Remova os bulbos olfatórios e o cerebelo.

Faça uma incisão na linha média entre os dois hemisférios para separar o córtex.

Remova as meninges para evitar a contaminação na cultura de astrócitos por fibroblastos e células meníngeas.

Transfira os hemisférios do córtex para um meio gelado e pique em pedaços pequenos.

Recolher as peças corticais num tubo contendo tripsina. A tripsina, uma enzima protease, digere as proteínas de adesão celular, facilitando a separação celular.

Centrifugue para pellet o tecido digerido.

Remova o sobrenadante e adicione um meio de astrócitos ao pellet. Pipete vigorosamente para liberar uma população de células mistas de astrócitos, micróglia e células precursoras de oligodendrócitos ou OPCs.

Semeie esta suspensão celular em um frasco de cultura de tecidos revestido de polilisina e incuba.

As células carregadas negativamente se ligam à polilisina carregada positivamente e crescem em toda a superfície para formar uma camada confluente.

Agite o frasco para separar a micróglia e os OPCs frouxamente ligados. Remova o sobrenadante contendo células separadas.

Adicione tripsina à camada de astrócitos. Recolha as células e centrifugue.

Ressuspenda o pellet e divida os astrócitos em vários frascos.

Finalmente, avalie a pureza da cultura de astrócitos por imunomarcação de marcadores específicos de células.

Transfira o prato contendo os cérebros para um estereomicroscópio. Em seguida, para isolar os córtices, agarre a extremidade posterior de cada cérebro com uma pinça fina e faça uma incisão na linha média entre os hemisférios.

Em seguida, insira um segundo conjunto de pinças no sulco criado e retire a estrutura em forma de placa do córtex do resto do cérebro.

Depois que todos os córtices forem isolados, retire cuidadosamente as meninges do córtex puxando com a pinça fina. Esta etapa evita a contaminação da cultura final de astrócitos por células meníngeas e fibroblastos.

Transfira os hemisférios corticais preparados para um segundo prato cheio de HBSS resfriado e coloque no gelo. Continue de acordo com todos os quatro córtices. Finalmente, corte cada hemisfério em quatro a oito pedaços pequenos usando lâminas afiadas.

Em condições estéreis, transfira os pedaços de córtex para um tubo Falcon de 50 mililitros e adicione HBSS a um volume final de 22,5 mililitros. Em seguida, adicione 2,5 mililitros de tripsina a 2,5%.

Recoloque a tampa, misture e incube o tecido no banho-maria a 37 graus Celsius por 30 minutos. Misture agitando a cada 10 minutos. Em seguida, depois de centrifugar por 5 minutos a 300 x g para pellet os pedaços de tecido do córtex, decantar cuidadosamente o sobrenadante.

Adicione 10 mililitros de meio de plaqueamento de astrócitos ao pellet e use uma pipeta de 10 mililitros para pipetar vigorosamente o meio que contém o tecido para cima e para baixo 20 a 30 vezes até que uma única suspensão celular seja obtida.

Em seguida, adicione o meio de plaqueamento de astrócitos a um volume final de 20 mililitros e conte as células usando um hemocitômetro ou contador de células automatizado de acordo com os procedimentos padrão.

Uma preparação de quatro córtices de filhotes de camundongo deve render 10 a 15 vezes 10 para a sexta célula única dissociada. Por fim, aspirar a poli-D-lisina de um balão previamente preparado e transferir a suspensão celular dissociada para o balão.

Incube a cultura a 37 graus Celsius na incubadora de cultura de tecidos por 2 dias e depois troque o meio. A mídia deve ser trocada a cada 3 dias a partir de então.

O astrócito deve parecer confluente com uma camada sobrejacente de micróglia após 7 a 8 dias em cultura. Neste ponto, coloque o frasco T75 em um agitador orbital ajustado em 180 rotações por minuto por 30 minutos para remover a micróglia.

Descarte o sobrenadante contendo microglia ou gire-o para baixo e coloque em um prato para cultura. Em seguida, adicione 20 mililitros de meio de cultura de astrócitos frescos e continue agitando o frasco a 240 rpm por 6 horas para remover as células precursoras de oligodendrócitos.

Como alguns OPCs não se desprendem completamente da camada de astrócitos, continue a agitar vigorosamente com a mão por 1 minuto para evitar a contaminação por OPC. Novamente, descarte o sobrenadante ou gire-o em um prato para cultivar OPCs.

Enxágue a camada de astrócitos confluente restante duas vezes com PBS. Aspire o PBS e adicione 5 mililitros de tripsina-EDTA. Incubar na incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius.

Verifique o desprendimento dos astrócitos a cada 5 minutos e reforce o desprendimento dos astrócitos batendo o frasco contra a palma da sua mão duas a três vezes.

Uma vez que os astrócitos tenham se destacado do frasco, adicione 5 mililitros de meio de cultura de astrócitos. Gire as células a 180 x g por 5 minutos, aspire o sobrenadante e adicione 40 mililitros de meio de plaqueamento de astrócitos frescos.

Um frasco T75 de células corticais mistas deve render cerca de 1 vez 10 para as sextas células enriquecidas para astrócitos após a primeira passagem.