Geração de células-tronco neurais induzidas (iNSCs) a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMNCs): um procedimento baseado em vírus de Sendai para reprogramar PBMNCs em iNSCs

Para reprogramar células somáticas em células-tronco neurais induzidas ou iNSCs - células-tronco que possuem alta capacidade de auto-renovação e diferenciação, comece cultivando células mononucleares do sangue periférico em um meio livre de soro para expandir os eritroblastos.

Em seguida, pipete a suspensão eritroblástica para uma placa de cultura. Trate as células com o vírus Sendai recombinante ou SeV. Esses vírus codificam fatores de transcrição de reprogramação. Centrifugue para sedimentar as células e incubar.

Após a fusão do SeV com a membrana da célula hospedeira, o genoma do vírus sofre transcrição seguida de tradução no citoplasma. A expressão ectópica de fatores de transcrição desencadeia o processo de reprogramação celular sem integrar os genes ao genoma do hospedeiro.

Agora, centrifugue a cultura para remover os vírus. Ressuspender as células transduzidas num meio adequado, seguido de plaqueamento. Além disso, centrifugue para remover detritos celulares. Ressuspenda as células no meio iNSC.

Posteriormente, semeie as células em uma placa revestida de proteínas. As células se ligam ao revestimento de proteína na placa. Complemente as células aderidas com meio iNSC em dias alternados. Após uma semana de cultura, substitua a mídia gasta por novas mídias iNSC diariamente.

Os fatores de crescimento e constituintes químicos no meio mantêm a auto-renovação e suportam a pluripotência de um subconjunto de células transduzidas, reprogramando-as completamente para iNSCs. Com o tempo, as células começam a formar colônias de iNSC. Selecione as colônias desejadas para cultivo.

No dia 0, colete as células em meio MNC e transfira para um tubo cônico de 15 mililitros. Depois de centrifugar as células a 200 x g durante 5 minutos, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células com 1 mililitro de meio MNC pré-aquecido. Conte as células viáveis com Trypan Blue e, em seguida, ressuspenda-as com meio MNC pré-aquecido até uma concentração de 200.000 células por poço em placas de 24 poços.

Descongele os tubos removidos do armazenamento de 80 graus Celsius negativos contendo o vírus Sendai em banho-maria a 37 graus Celsius por 5 a 10 segundos e depois deixe-os descongelar em temperatura ambiente. Depois de descongelados, coloque-os imediatamente no gelo. Adicione o vírus Sendai descongelado aos poços da placa de 24 poços com MNCs em uma multiplicidade de infecção de 10. Para facilitar a fixação das células, centrifugue as placas a 1.000 x g por 30 minutos e, em seguida, coloque as placas na incubadora a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono.

No dia 1, transfira as células com o meio para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Para separar ainda mais as células restantes, enxágue os poços com 1 mililitro de meio MNC por poço e adicione as células com meio ao tubo. Depois de centrifugar esta suspensão celular a 200 x g por 5 minutos, aspire o sobrenadante, ressuspenda as células com 500 microlitros de meio MNC fresco pré-aquecido e adicione a um poço de uma placa de 24 poços.

No dia 2, use 1 mililitro por poço de 50 microgramas por microlitro de poli-D-lisina e D-PBS previamente diluídos para revestir placas de 6 poços por pelo menos 2 horas em temperatura ambiente. Aspire poli-D-lisina das placas de 6 poços e seque na bancada vertical limpa por cerca de 10 minutos. Em seguida, adicione 1 mililitro por poço de 5 microgramas por mililitro de laminina previamente diluída às placas de 6 poços e incube por 4 a 6 horas a 37 graus Celsius para revestir. Lave as placas com D-PBS antes de usar.

No dia 3, a placa de todos os vírus Sendai transduziu MNCs em meio de células-tronco neurais induzidas nas placas de 6 poços revestidas com laminina poli-D-lisina. Nos dias 5 e 7, adicione suavemente 1 mililitro de meio iNSC pré-aquecido a 37 graus Celsius a cada poço das placas de 6 poços.

Do dia 9 ao dia 28, substitua o meio por meio iNSC fresco pré-aquecido diariamente. Monitore o surgimento de colônias de iNSC e, em cerca de 2 a 3 semanas, escolha colônias com morfologia apropriada usando pipetas de vidro queimado. Em seguida, transfira cada colônia para um poço separado de uma placa de 6 poços para expansão.