Preparação de andaime semeado MSC: uma técnica para preparar andaime semeado com células-tronco mesenquimais para implantação cirúrgica em modelo murino

As células cancerígenas produzem fatores quimiotáticos de homing para atrair as células-tronco mesenquimais ou MSCs dos vasos sanguíneos em direção ao local do tumor.

Para estudar o efeito dessas células no crescimento do tumor in vitro, comece usando um substrato de andaime esterilizado. Transfira-o para uma placa de poço contendo o meio desejado para pré-umedecer o andaime. Coloque-o em uma superfície seca para remover o excesso de mídia grudado no andaime para melhor adesão celular. Transfira o andaime parcialmente seco para um poço fresco. Semeie uma gota de suspensão de MSC no andaime.

Além disso, adicione mais meio nos cantos do poço para criar uma câmara de hidratação que evite a evaporação do meio da gota durante a incubação subsequente. Incube para permitir que as MSCs adiram à superfície do andaime. Vire o andaime para expor a superfície não semeada. Pipete uma nova gota de suspensão MSC deste lado e deixe os MSCs aderirem.

Depois que as MSCs aderirem a ambos os lados do andaime, cubra-o com mais meio, garantindo que todas as células estejam em contato com o meio. Incube até que as MSCs cresçam e se infiltrem nos interstícios e poros do andaime. O andaime semeado MSC está pronto para implantação cirúrgica.

Prepare os andaimes 48 horas antes da implantação em camundongos, cortando primeiro os andaimes de PLA em pedaços do tamanho de uma cavidade de ressecção de aproximadamente 2 por 2 milímetros. Esterilize os andaimes imergindo em etanol 70% por 15 minutos. Após 15 minutos, mergulhe os andaimes em PBS. Em seguida, coloque os andaimes no Meio de Eagle Modificado de Dulbecco contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina enquanto prepara as células para a semeadura.

Para preparar as células, primeiro, levante as MSCs cultivadas usando 0,05% de tripsina. Incube a 37 graus Celsius por 5 minutos. Após a incubação, certifique-se de que as células foram levantadas. Em seguida, adicione DMEM ao frasco para inativar a tripsina. Em seguida, transferir o conteúdo do balão para um tubo de centrifugação de 15 mililitros. Conte as células usando um hemocitômetro. Em seguida, pastilha 5 vezes 10 elevado ao quinto MSC para cada andaime por centrifugação a 100 x g durante 5 minutos.

Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender as MSCs em 5 microlitros de DMEM por 5 vezes 10 até a quinta célula. Em seguida, remova um andaime da imersão em DMEM com uma pinça e coloque-o na tampa da placa de 6 poços. Levante o andaime da tampa, deixando para trás uma gota de excesso de DMEM. Coloque o andaime de volta na tampa novamente em um novo local seco. Repita três a cinco vezes. Em seguida, coloque o andaime parcialmente seco em uma nova placa de 6 poços para semeadura.

Um andaime parcialmente seco fornece resultados ideais de semeadura celular. Se o andaime estiver muito molhado, as células deslizarão para fora do andaime e aderirão à placa abaixo. Se o andaime secar, a gotícula não se espalhará por todo o andaime, resultando em má distribuição celular inicial.

Usando uma pipeta, misture suavemente o tubo de MSCs para homogeneizar a suspensão, pois algumas células podem ter se depositado no fundo. Pipete lentamente 2,5 microlitros de suspensão MSC recém-misturada diretamente no andaime, criando uma pequena gota sobre o topo do andaime. Adicione 300 microlitros de DMEM às bordas de cada poço para evitar a evaporação rápida da gota da célula. Incube a 37 graus Celsius por 30 minutos, permitindo que as células se prendam ao andaime.

Após a incubação, use uma pinça para virar suavemente os andaimes na placa do poço. Semeie 2,5 microlitros de suspensão de MSC recém-misturada para dar um total de 5 vezes 10 às quintas células semeadas por andaime. Após uma incubação de 30 minutos para permitir que as células se fixem ao andaime, cubra os andaimes com DMEM adicionando 2 mililitros a cada poço da placa de 6 poços. Levante suavemente os andaimes para permitir que a mídia flua por baixo deles. Incube a 37 graus Celsius neste estado por 48 horas antes da cirurgia de implantação.