Ressecção tumoral guiada por fluorescência e implantação de andaime semeado por MSC em modelo murino: um procedimento cirúrgico para entregar células-tronco mesenquimais terapêuticas na cavidade de ressecção de tumor cerebral em modelo de camundongo

As células-tronco mesenquimais ou MSCs podem ser geneticamente modificadas para expressar o ligante indutor de apoptose relacionado ao fator de necrose tumoral ou TRAIL, que se liga a receptores específicos em células tumorais induzindo apoptose.

Para entregar essas MSCs em um modelo de camundongo portador de tumor, primeiro prepare um andaime de biopolímero semeado com MSC que expressa TRAIL. Em seguida, prenda um camundongo anestesiado com tumor cerebral marcado com fluorescência em uma estrutura estereotáxica. O camundongo tem uma janela craniana pré-estabelecida para acessar o cérebro.

Mantenha a temperatura corporal do mouse com uma almofada de aquecimento. Esterilize o local da cirurgia e faça uma incisão na linha média do couro cabeludo. Remova a gordura subdérmica para revelar a janela craniana. Retire a dura-máter da janela, expondo o tecido parenquimatoso subjacente e o tumor.

Agora, sob um estereomicroscópio de fluorescência, visualize o tumor fluorescente. Aspire o tecido tumoral fluorescente do cérebro. Lave com solução salina para restaurar o pH fisiológico. Implante o andaime semeado por MSC na cavidade de ressecção. Aplique um agente hemostático adequado para prender o andaime no lugar. Feche a incisão e permita que o mouse se recupere.

Após a implantação, as células tumorais dentro dos focos tumorais residuais secretam fatores solúveis, que facilitam a migração de MSCs do andaime para as células tumorais. As proteínas TRAIL secretadas pelas MSCs se ligam a receptores específicos nas células tumorais, induzindo a morte celular apoptótica.

Comece colocando a estrutura estereotáxica no palco de um estereomicroscópio de dissecação de fluorescência. Em seguida, prenda o mouse anestesiado na estrutura estereotáxica com suprimento contínuo de anestesia inalada por meio de um adaptador de cone nasal de isoflurano. Mantenha a temperatura corporal com uma almofada de aquecimento. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento da córnea. Em seguida, esterilize o local da incisão do couro cabeludo com uma série de três lenços umedecidos com álcool e três betadinas.

Realize o teste de reflexo de pinça do dedo do pé em cada membro e confirme a resposta negativa para garantir a anestesia adequada. Usando uma pinça, aperte e levante suavemente o couro cabeludo. Depois de fazer uma incisão róstral-caudal linear na linha média com tesoura cirúrgica, irrigue o local da incisão com PBS e remova a gordura subdérmica com um aplicador de ponta de algodão em um movimento circular de escovação.

Disponha a pele de forma que a janela craniana previamente estabelecida seja totalmente visível. Use uma agulha de calibre 18 para perfurar suavemente a dura-máter logo no interior das bordas da janela craniana. Repita até que a incisão trace totalmente o interior da janela. Remova a dura-máter retirando-a com uma pinça fina, revelando o parênquima e o tumor subjacentes.

Em seguida, diminua as luzes da sala e ative o modo de fluorescência do estereomicroscópio. Localize o tumor U87 mCherry e o tumor que expressa luciferase de vaga-lume. Carregue uma ponta de pipeta de 200 microlitros na extremidade da tubulação de uma bomba de vácuo. Em seguida, ligue a bomba de vácuo. Ressecção o tumor aspirando suavemente o tecido fluorescente até que não haja mais sinal. Para controlar o sangramento, irrigue com PBS frio e aplique pressão constante com um aplicador de ponta de algodão.

Use uma combinação de solução salina, pressão constante com um aplicador de ponta de algodão e/ou um agente hemostático, como SURGICEL, para parar o sangramento antes de implantar o andaime. Se não for devidamente controlado, um hematoma potencialmente perigoso pode se formar. Após a ressecção, desligue a bomba de vácuo e descarte a ponta da pipeta. Desligue a fluorescência e as luzes da sala voltam a acender. Imediatamente antes da implantação, mergulhe lentamente um andaime de PLA semeado por MSC em PBS para remover meios indesejados e componentes associados. Implante o andaime na cavidade de ressecção.

Se necessário, adicione 1 microlitro de fibrinogênio, seguido de 1 microlitro de trombina para prender o andaime no lugar. Com a dura-máter removida e o retalho ósseo da janela craniana já descartado, selar a ferida fechando a pele e aplicando cola cirúrgica. Remova o animal do anestésico inalado e deixe-o se recuperar em uma superfície aquecida.