JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 3:39 min • July 8th, 2025
A imagem do câncer cerebral in vivo envolve a injeção de células cancerígenas marcadas com fluorescência no cérebro do camundongo para observar o desenvolvimento do tumor. Para marcação fluorescente, incube células de glioma com partículas de lentivírus. O vetor lentiviral carrega o gene da proteína fluorescente infravermelha, iRFP.
O vírus se liga à superfície da célula do glioma e libera RNA na célula. As enzimas celulares convertem o RNA viral em DNA de fita dupla, que se integra ao genoma celular e permite a expressão de iRFP. Os máximos de excitação e emissão do iRFP estão dentro de uma região do infravermelho próximo, onde os tecidos têm absorbância e espalhamento mínimos. Isso permite imagens precisas de tecidos profundos.
Em seguida, remova o meio gasto e adicione tripsina. A tripsina, uma enzima protease, digere as proteínas de adesão, separando as células da superfície do frasco. Pipete repetidamente para separar as células individuais. Recolher a suspensão celular num tubo e centrifugar. Agora, adicione um buffer adequado para ressuspender o pellet.
Dispense a suspensão celular em tubos de citometria de fluxo e core as células com um corante fluorescente, DAPI. O DAPI cora o núcleo das células mortas de azul brilhante, distinguindo-as das células vivas. Usando um classificador de células ativadas por fluorescência ou FACS, classifique as células vivas positivas para iRFP de outras populações de células com base em sua fluorescência. As células isoladas podem ser usadas para injeção em camundongos para imagens de tumores.
Comece semeando 1 vezes 10 até a sexta célula de glioblastoma em 5 mililitros de meio em um prato de 10 centímetros para uma incubação de 24 horas em uma incubadora de cultura de células. Na manhã seguinte, transduza as células com lentivírus expressando uma proteína fluorescente apropriada de interesse em uma multiplicidade de infecção de 5 e devolva as células à incubadora.
Após 24 horas, substituir o sobrenadante por 5 mililitros de meio fresco e incubar a cultura por mais 48 horas. No final da incubação, substitua o meio por 3 a 5 mililitros de tripsina por 10 a 15 minutos a 37 graus Celsius, seguido de pipetagem cuidadosa para dissociar totalmente as células destacadas.
Colete as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em 500 microlitros de solução de classificação. Divida as células no número apropriado de tubos FACS e costain as células com DAPI para exclusão de células mortas. Em seguida, carregue os tubos no citômetro de fluxo e classifique as células vivas de acordo com sua expressão de construção fluorescente em um tubo cônico de 15 mililitros contendo uma solução de classificação fresca.
Após a centrifugação, ressuspenda as células positivas / negativas em 5 mililitros de meio de cultura e semeie-as em um novo prato de 10 centímetros para sua cultura a 37 graus Celsius por 48 a 72 horas. No final da incubação, divida as células para semeadura em vários pratos para experimentos in vivo subsequentes.