Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 4:15 min. • July 8th, 2025
As células-tronco tumorais cerebrais ou BTSCs, uma subpopulação de células tumorais cerebrais, podem iniciar o crescimento e metástase do tumor, tornando-as alvos promissores para a terapia do câncer. Para estudar o efeito dos medicamentos na migração de BTSC in vitro, primeiro prepare suspensões uniformes de BTSCs em um meio adequado. Trate uma das suspensões com o medicamento de interesse.
Enquanto isso, obtenha uma placa de quimiotaxia de vários poços composta por inserções membranosas que separam cada poço em câmaras superior e inferior. Pipeta desejada proteína da matriz extracelular para as câmaras inferiores e inserções membranosas. Incubar para facilitar a polimerização da proteína.
Adicione um meio basal adequado contendo o quimioatraente desejado nas câmaras inferiores e coloque sobre as inserções membranosas. Em seguida, semeie a suspensão de BTSC tratada com drogas e não tratada em inserções membranosas. Imagem da placa por um período prolongado usando microscopia de células vivas.
Em cultura, as BTSCs aderem à matriz proteica da inserção. Em resposta ao gradiente de concentração de quimioatraente estabelecido entre as câmaras superior e inferior, as BTSCs não tratadas migram através da matriz proteica através dos poros de inserção da membrana para a câmara inferior.
No entanto, o tratamento medicamentoso afeta negativamente a atividade funcional das células, diminuindo a migração de BTSC. Agora, usando um software adequado, analise e quantifique as BTSCs migradas nas câmaras inferiores. As BTSCs não tratadas apresentam aumento da migração, enquanto as BTSCs tratadas com medicamentos apresentam migração reduzida.
Para avaliar os efeitos de um tratamento medicamentoso de interesse na migração, primeiro, pré-trate as células com a concentração apropriada do medicamento por um período experimental adequado. Para preparar a placa de quimiotaxia, revestir três poços de inserção de membrana e três poços de reservatório de fundo por condição de uma placa de quimiotaxia de 96 poços com 75 e 225 microlitros de 0,2 miligramas por mililitro de colágeno tipo I, respectivamente, por 1 hora a 37 graus Celsius.
No final da incubação, aspire a solução de colágeno de cada poço sem arranhar o revestimento de colágeno e lave os poços duas vezes com PBS estéril. Após a última lavagem, remova o inserto da placa e adicione 225 microlitros de meio livre de fator de crescimento suplementado com 10% de FBS a cada poço do reservatório inferior da placa de quimiotaxia.
Em seguida, retorne suavemente o inserto superior ao reservatório inferior em um ângulo para evitar a criação de bolhas e adicione 2,5 vezes 10 ao terceiro BTSCs dissociado em 50 microlitros de meio livre de fator de crescimento a cada poço de inserto. É importante dissociar totalmente as BTSCs em células individuais e contá-las cuidadosamente antes do plaqueamento para evitar aglomerados de células ou muitas células na inserção superior.
Para obter imagens da migração BTSC ao longo do gradiente FBS, coloque a placa em um sistema de imagem de células vivas e configure o software de imagem automatizado para adquirir imagens microscópicas da placa a cada 1 a 2 horas por até 72 horas. Quando a aquisição da imagem estiver concluída, selecione uma nova definição de processamento para distinguir as BTSCs de seus poros de inserção na parte inferior da membrana, modificando a análise se ela não distinguir com precisão as células da membrana de fundo, conforme necessário.
Para quantificar as células que migraram através dos poros, colete os dados como a área da superfície celular na parte inferior da membrana para cada um dos três poços replicados por condição. Em seguida, represente graficamente a migração celular à medida que a área das células migrou em micrômetros ao quadrado ao longo do tempo.