Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 4:32 min. • July 8th, 2025
As células-tronco tumorais cerebrais ou BTSCs - um subconjunto de células dentro dos tumores cerebrais - possuem capacidades de auto-renovação e contribuem para a progressão do tumor e resistência à terapia. Para determinar o efeito dos medicamentos na invasão de BTSC in vitro, comece com suspensões de BTSC em um meio adequado em frascos de cultura. Trate uma das suspensões com o medicamento de interesse.
Incubar os frascos. Os componentes do meio promovem a proliferação celular. As células permanecem em suspensão, formando aglomerados esféricos chamados neuroesferas. Ao atingir o tamanho desejado, colete as neuroesferas. Deixe-os sedimentar por gravidade e remover o meio. Em seguida, ressuspenda as neuroesferas não tratadas e tratadas com drogas em meio resfriado contendo uma proteína da matriz extracelular adequada e a droga.
Coloque as suspensões em uma placa de vários poços resfriada. Permita que as neuroesferas sedimentem até o fundo do poço para obter melhores imagens. Em seguida, incube para polimerização da proteína da matriz, incorporando as neuroesferas internas. Visualize as neuroesferas por um período prolongado usando microscopia de células vivas. Em cultura, as BTSCs incorporadas secretam enzimas proteolíticas, que degradam as proteínas da matriz, permitindo a migração celular.
Com o tempo, o aumento da degradação da matriz cria um microambiente apropriado para a invasão de BTSC das neuroesferas para a matriz circundante. Usando um software adequado, meça a área total da superfície das neuroesferas em diferentes pontos de tempo. As BTSCs não tratadas apresentam maior área de superfície, indicando uma taxa de invasão aumentada do que as BTSCs tratadas com medicamentos.
Para avaliar a invasão da neuroesfera BTSC, primeiro, adicione o composto de interesse ao frasco na concentração desejada para o curso de tempo predeterminado antes do plaqueamento da invasão da neuroesfera. Quando o tamanho médio da neuroesfera atingir aproximadamente 150 a 200 micrômetros, incline e misture suavemente o frasco com uma pipeta e transfira 500 microlitros das neuroesferas BTSC ressuspensas para um tubo de 1,5 mililitro por condição experimental no gelo.
Aspire o máximo possível do meio do fundo de cada tubo de 1,5 mililitro sem perder o pellet da neuroesfera e ressuspenda suavemente as neuroesferas em 500 microlitros de solução de colágeno tipo I de 0,4 miligrama por mililitro recém-preparada. Transfira 100 microlitros das neuroesferas suspensas de colágeno para três poços por condição para uma nova placa de 96 poços no gelo e deixe as neuroesferas assentarem por 5 minutos.
É fundamental permitir que as neuroesferas se estabeleçam por 5 minutos no gelo. Caso contrário, as esferas não estarão no mesmo plano de foco para a imagem. Após 5 minutos de polimerização de colágeno na incubadora de cultura de células, transfira a placa para a bandeja do sistema de imagem de células vivas para adquirir uma imagem de referência do tamanho da neuroesfera no momento do plaqueamento, antes do início da invasão. Em seguida, configure o software para adquirir imagens a cada 1 a 2 horas até que a taxa de invasão se estabilize, normalmente em 24 horas.
Para obter imagens da área de superfície crescente das BTSCs à medida que invadem a matriz ao longo do tempo, use a objetiva de 10x para adquirir quatro imagens por poço para cada conjunto de três poços replicados. Para determinar a área relativa da superfície celular representada como a porcentagem de confluência do poço, configure uma definição de processamento que destaque especificamente as células sobre o fundo do poço. Em seguida, colete os dados como a área total da superfície celular para cada poço em cada ponto de tempo. Determine a média dos três poços replicados e represente graficamente a invasão das BTSCs traçando a área celular crescente ao longo do tempo.