Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 4:13 min. • July 8th, 2025
O glioblastoma possui células-tronco que migram ao longo dos tratos axonais dos neurônios mielinizados para invadir locais distantes no cérebro. Para recapitular a migração de células de glioblastoma ou GBM em neurônios in vitro, comece pegando uma lamínula de vidro.
Ative a lamínula por tratamento com plasma de oxigênio e prepare-a com um agente funcionalizante. Este tratamento suporta fácil acesso aos produtos químicos nas etapas subsequentes. Adicione a solução PEGilada à lamínula e incube. Esta solução reveste a lamínula, impedindo a adesão dos neurônios em locais aleatórios.
Dispense um polímero fotoiniciador na lamínula e monte-o na câmara de imagem. Coloque a câmara no palco de um microscópio de fluorescência. Uma vez dentro, a iluminação UV ativa as moléculas fotoiniciadoras localmente nas áreas designadas correspondentes aos micropadrões previstos.
As moléculas fotoiniciadoras ativadas clivam a camada PEG subjacente, gerando o padrão desejado. Agora, adicione a solução de laminina e incuba. A laminina - uma glicoproteína - é depositada em locais específicos onde a camada de PEG foi removida. Semeie o meio contendo neurônios do hipocampo de ratos na lamínula.
Incubar para permitir a aderência dos neurônios nas matrizes revestidas de laminina para obter lamínulas micropadronizadas por neurônios. Deposite uma suspensão de células GBM marcadas com fluorescência sobre os neurônios micropadronizados. Imagem para ver as células fluorescentes GBM migrando nos neurônios.
Para fazer um substrato para a micropadronização, trate lamínulas circulares de vidro de 18 milímetros por ativação por ar ou plasma por 5 minutos antes de colocar as lamínulas em um dessecador com 100 microlitros de trietoxissilano 3-aminopropil por 1 hora. Em seguida, incube uma solução de Peg-SVA a 100 miligramas por mililitro por 1 hora para deposição de gel. No final da incubação, adicione 3 microlitros de PLPP e 50 microlitros de etanol absoluto no centro da lâmina e espere até que seque completamente.
Para micropadronização de lâminas de vidro, monte a lamínula em uma câmara Ludin e coloque a câmara no palco de um microscópio equipado com um sistema de foco automático. Após a imagem, carregue as imagens micropadronizadas no software. Após o sequenciamento automático da iluminação UV, use uma pipeta para lavar o PLPP da lamínula extensivamente com PBS. Em seguida, incubar a lamínula com 50 microgramas por mililitro de laminina durante 30 minutos, seguida de outra lavagem com PBS, conforme demonstrado.
Para configurar uma cultura embrionária de neurônios do hipocampo de ratos nas lamínulas micropadronizadas, após a última lavagem, reidratar as lâminas de vidro com meio de cultura de células neuronais. Semeie 5 vezes 10 até o quarto neurônios do hipocampo de ratos suspensos em meio neurobasal enriquecido com 3% de soro de cavalo por centímetro quadrado em cada lamínula micropadronizada para uma incubação de 24 horas em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Centrifugue células de glioblastoma dissociadas por 5 minutos a 1.000 rpm e ressuspenda o pellet em meio de cultura de células de glioblastoma. Em seguida, deposite 1 vezes 10 nas terceiras células GBM sobre os neurônios micropadronizados.