Isolamento e Cultura de Pericitos Cerebrais Primários: Um Procedimento para Isolar e Cultivar Pericitos de Capilares Cerebrais Bovinos Sem Contaminação de Células Endoteliais

No sistema nervoso central, os pericitos são células multifuncionais que envolvem as células endoteliais, que formam o revestimento celular interno dos capilares. Os pericitos ajudam a regular o fluxo sanguíneo e a manter a homeostase cerebral.

Para isolar pericitos, comece tomando capilares cerebrais bovinos congelados em um frasco. Após o descongelamento, transfira o conteúdo para um tubo contendo a mídia desejada. Centrifugue para peletar os capilares. Remova o sobrenadante contendo mídia de congelamento. Ressuspender o sedimento capilar em meio e semear a suspensão num balão revestido de proteínas da matriz extracelular.

Incubar para permitir que os capilares adiram ao revestimento do balão. Substitua a mídia por mídia contendo heparina. Em cultura, o revestimento proteico da matriz extracelular promove a migração dos pericitos para longe dos fragmentos capilares e prolifera, enquanto a heparina estimula a migração das células endoteliais.

Substitua a mídia gasta por mídia contendo heparina. Com o tempo, os pericitos projetam processos alongados que aderem fortemente ao frasco. Com espaço limitado no substrato, as células endoteliais proliferam e formam uma monocamada inibida por contato. Ao atingir a densidade adequada de pericitos, remova o meio e lave o frasco com tampão.

Use tripsina-EDTA para separar as células endoteliais fracamente ligadas do frasco. Posteriormente, adicione meios para neutralizar a atividade da tripsina-EDTA. Lave com meio repetidamente para remover as células endoteliais descoladas. Adicionar meios e assegurar que os pericitos permanecem presos ao balão. Incube a cultura enriquecida com pericito para proliferar.

Comece descongelando um frasco de capilares em banho-maria a 37 graus Celsius. Uma vez descongelados os capilares, transfira-os para um tubo de centrífuga com 30 mililitros de DMEM-comp e centrifugue-os por 5 minutos a 500 x g. Em seguida, remova o meio do tubo e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de DMEM-comp fresco. Transfira a suspensão para um frasco T75 revestido e deixe os capilares aderirem ao fundo por 4 a 6 horas em uma incubadora a 37 graus Celsius fornecida com 10% de dióxido de carbono. Após a incubação, inspecionar o frasco sob um microscópio óptico.

Frações de capilares devem agora ser fixadas no fundo do frasco. No dia 4, após a semeadura dos capilares, inspecione-os ao microscópio para garantir que estejam aproximadamente 60% a 70% confluentes. Aspire o meio e lave suavemente as células com PBS. Adicione 2 mililitros de tripsina-EDTA descongelado e deixe o frasco na incubadora por 1 a 3 minutos, retirando o frasco com frequência e observando o descolamento celular com o microscópio. Quando as células endoteliais começarem a se arredondar, bata suavemente no frasco para soltá-las.

Quando as células se desprenderem, interrompa a tripsinização adicionando 10 mililitros de DMEM-comp ao frasco. Lave o frasco algumas vezes com o meio e aspire a suspensão de células endoteliais, que agora pode ser usada para outros fins. Adicionar 10 mililitros de DMEM-comp ao balão e verificá-lo ao microscópio óptico para se certificar de que os pericitos ainda estão presentes e presos ao fundo. Em seguida, coloque o frasco de volta na incubadora para permitir que a cultura enriquecida com pericitos cresça.