Isolamento de capilares cerebrais do cérebro humano: um método otimizado para extrair capilares cerebrais do tecido cerebral humano

Os capilares cerebrais são um componente vital da barreira hematoencefálica - uma barreira semipermeável que permite o movimento seletivo de solutos entre o sangue e o cérebro. Para isolar os capilares cerebrais, comece com tecido cerebral humano fresco. Remova as meninges e corte a substância branca.

Pique o tecido cerebral em fragmentos menores. Transferir os fragmentos para um homogeneizador contendo um tampão adequado e homogeneizar. A homogeneização desintegra os tecidos, liberando capilares e detritos teciduais na solução.

Transferir o homogeneizado para um tubo novo e adicionar um volume óptimo de um meio de gradiente de densidade adequado. Centrifugue a solução para peletar os capilares. Muito ou pouco meio gradiente de densidade resulta em baixo rendimento capilar. Remova o sobrenadante.

Ressuspenda o pellet em albumina de soro bovino ou tampão suplementado com BSA. A BSA estabiliza as enzimas digestivas e mantém a integridade estrutural dos capilares. Em seguida, filtre a solução com um filtro apropriado para remover grandes vasos e detritos de tecido.

Em seguida, passe o filtrado por um filtro de malha menor. Este filtro retém os capilares cerebrais e permite a passagem de detritos menores e glóbulos vermelhos. Em seguida, vire o filtro e lave os capilares em um tubo novo com tampão suplementado com BSA.

Centrifugue a solução e remova o sobrenadante. Ressuspenda os capilares puros no tampão e guarde-os para uso posterior.

Para iniciar este procedimento, documente o peso do tecido cerebral humano, que deve ser de cerca de 10 gramas. Sob o microscópio, remova cuidadosamente todas as meninges com uma pinça e use um bisturi para cortar a substância branca. Em seguida, corte cuidadosamente o tecido cerebral e pique-o com um bisturi por cerca de 5 minutos.

Transfira o tecido cerebral para o moedor de tecido e adicione 30 mililitros de tampão de isolamento. Em seguida, homogeneizar cada amostra com 100 golpes a 50 rpm. Não mexa no ar para evitar bolhas. Documente o tempo a cada 25 golpes e o tempo total necessário para 100 golpes. Em seguida, transfira o homogeneizado para um homogeneizador Dounce no gelo. Homogeneizar a suspensão por cerca de 20 golpes e evitar bolhas.

Em seguida, distribua o homogeneizado cerebral igualmente em quatro tubos de centrifugação de 50 mililitros e documente o volume total do homogeneizado. Certifique-se de adicionar o volume correto de Ficoll. Muito pouco ou muito Ficoll resultará em uma densidade incorreta para separar os capilares dos detritos celulares e, portanto, reduzirá o pellet capilar e limitará o rendimento.

Use 10 mililitros de tampão de isolamento para enxaguar o pilão e o homogeneizador e distribuí-lo nos quatro tubos de centrifugação. Em seguida, distribua 50 mililitros de tampão de gradiente de densidade nos tubos de centrifugação. Feche bem os tubos da centrífuga com tampas. Depois, misture o homogeneizado, o meio de gradiente de densidade e tampão agitando vigorosamente os tubos. Centrifugue a 5.800 x g por 15 minutos a 4 graus Celsius. Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda cada pellet em 2 mililitros de 1% de BSA.

Depois de ressuspender o pellet, filtre a suspensão através da malha de 300 micrômetros. Os capilares são filtrados através da malha, enquanto vasos maiores e detritos cerebrais maiores permanecem na malha. Lave cuidadosamente a malha com até 50 mililitros de 1% de BSA e descarte a malha. Para separar os capilares dos glóbulos vermelhos e outros detritos cerebrais, distribua o filtrado capilar por filtros de tensão celular de 530 micrômetros.

Os capilares são retidos por este filtro, enquanto os glóbulos vermelhos, outras células individuais e pequenos detritos cerebrais passam pelo filtro e são coletados no filtrado. Em seguida, lave cada filtro com 25 mililitros de 1% BSA. Despeje todos os filtrados sobre o sexto filtro para aumentar o rendimento. Lave cada filtro com 50 mililitros de 1% de BSA. Manter os filtros de deformação celular que contêm os capilares e rejeitar o filtrado. Em seguida, vire os filtros de cabeça para baixo e lave os capilares com 50 mililitros de 1% de BSA em tubos de 50 mililitros.

Aplique pressão suavemente com a ponta da pipeta e mova-a pelo filtro para lavar os capilares cerebrais. Certifique-se de lavar todos os capilares cerebrais, especialmente da borda do filtro. Evite bolhas, pois isso dificulta o processo de filtração e aumenta a chance de perda capilar. Após a coleta dos capilares, centrifugue todas as amostras a 1.500 x g por 3 minutos a 4 graus Celsius. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em aproximadamente 3 mililitros de tampão de isolamento.

Em seguida, combine todos os pellets ressuspensos de uma amostra em um tubo cônico de 15 mililitros e encha-o com tampão de isolamento. Centrifugue novamente a 1.500 x g por 3 minutos a 4 graus Celsius e lave mais duas vezes. Documente a pureza capilar com um microscópio com ampliação de 100X e câmera. Os capilares cerebrais isolados agora podem ser usados para experimentos, processados ou congelados rapidamente e armazenados a 80 graus Celsius negativos em criotubos por um período mínimo de 6 a 12 meses.