Entrega de genes baseada em eletroporação in utero: uma técnica para injetar DNA de plasmídeo em células cerebelares embrionárias de embriões murinos

Comece tomando um modelo de camundongo fêmea anestesiado grávida colocado em decúbito dorsal. Prepare o mouse removendo os pelos da região abdominal. Incise a pele e as camadas musculares subjacentes para expor os cornos uterinos - os locais que hospedam embriões viáveis.

Agora, puxe os chifres uterinos para fora da cavidade abdominal. Pegue um capilar de vidro de ponta afiada contendo a solução de DNA de plasmídeo desejada. Localize o cérebro do embrião e injete a solução de DNA plasmidial através da parede do útero no quarto ventrículo. Esta posição é anterior ao primórdio cerebelar - o local desejado para uma eventual entrega de DNA.

Após a injeção, retraia o capilar vazio. Em seguida, para eletroporação do embrião injetado com DNA, posicione os dois eletrodos sobre a parede uterina de modo que o eletrodo positivo cubra o primórdio cerebelar e o eletrodo negativo cubra a região ao redor das orelhas.

Aplique pulsos elétricos pela duração desejada. Esses pulsos tornam as células neuronais cerebelares permeáveis, permitindo que o DNA do plasmídeo entre nas células-alvo. Finalmente, coloque os cornos uterinos de volta dentro da cavidade abdominal em sua posição natural. Suturar os cortes, transferir o rato para sua gaiola e deixá-lo se recuperar.

Comece carregando um capilar de vidro borossilicato em um extrator de micropipeta e puxando para criar uma ponta fina. Rotule a ponta capilar com tinta preta para melhor visualização durante a injeção e desenhe uma escala no vidro. Trabalhando sob um estereomicroscópio, use uma régua e uma pinça de agulha afiada para aparar a ponta em um comprimento de cerca de 6 milímetros e criar uma borda chanfrada afiada e unilateral.

Filtre uma solução estoque Fast Green a 1% através de um filtro de 0,22 mícron para remover partículas de corante da solução. Misturar os plasmídeos de RNA de guia único em partes iguais com o plasmídeo repórter de luciferase até obter uma concentração final de pelo menos 1 micrograma por mililitro para cada plasmídeo.

Pinte a solução de plasma com Fast Green a uma concentração final de 0,05%. Depois de anestesiar um camundongo CD-1 grávida com isoflurano, coloque o camundongo de costas em uma almofada de aquecimento e administre analgésico. Aplique pomada para os olhos para evitar o ressecamento dos olhos durante a cirurgia. Fixe os membros com fita adesiva e esterilize o abdômen com um desinfetante.

Cubra o mouse com gaze, deixando apenas a área cirúrgica exposta. Depois de fazer uma incisão na pele de cerca de 2 centímetros de comprimento, localize a linha alba e use uma tesoura de tecido de ponta romba para fazer uma segunda incisão um pouco menor através do peritônio. Umedeça a cavidade abdominal aberta com PBS estéril pré-aquecido.

Em seguida, use uma pinça de anel para extrair cuidadosamente os chifres uterinos da cavidade abdominal. Segure a parede uterina no espaço entre os sacos vitelos de dois embriões vizinhos e puxe suavemente. Evite qualquer pressão sobre o embrião enquanto o puxa pela incisão. Uma vez extraídos os cornos uterinos, aspirar aproximadamente 10 a 15 microlitros de solução plasmidial colorida com o capilar de vidro preparado. Evite bolhas de ar durante este processo.

Segure suavemente o embrião com uma pinça de anel e localize a área do pescoço. Penetre lentamente no rombencéfalo dorsal com a ponta do capilar de vidro e mova-se para o quarto ventrículo. Injete cerca de 1 microlitro da mistura de plasmídeo. Confirme se o DNA tingido não vazou do cérebro e é visível como uma estrutura em forma de diamante.

Aqui, é mais importante preencher toda a região do quarto ventrículo com solução de plasmídeo para entregar DNA também à parte distal do primórdio cerebelar. Ao mesmo tempo, certifique-se de não causar sangramento durante esse processo.

Coloque pinças de platina equipadas com placas de eletrodos de 5 milímetros de diâmetro lateralmente sobre a cabeça do embrião com o pólo negativo cobrindo a orelha e o pólo positivo posicionado no primórdio cerebelar sobre a parede uterina e aplique pulsos quadrados elétricos.

Quando todos os embriões tiverem sido eletroporados, coloque cuidadosamente os cornos uterinos de volta na cavidade abdominal e preencha com PBS estéril. Deixe o corno uterino deslizar para uma posição natural. Desligue a anestesia e coloque o animal de barriga para baixo em uma nova gaiola para se recuperar.